Indian Patents. 219583:A LIPOSOMAL FORMULATION

Title of Invention	A LIPOSOMAL FORMULATION
Abstract	The invention relates to a liposomal formulation comprising water-soluble glucocorticoids, to the use of said formulation in the treatment of inflammatory diseases, and to a kit comprising said liposomal formulation, e.g. in the form of a pharmaceutical agent.

Full Text	Liposomale Glucocorticoide Beschreibung Die Erfindung betrifft eine liposomale Formulierung umfas- send wasserlösliche Glucocorticoide, die Verwendung dieser Formulierung zur Behandlung von inflammatorischen Erkran- kungen sowie einen Kit, der die liposomale Formulierung, zum Beispiel als ein pharmazeutisches Mittel, umfasst. Glucocorticoide sind eine Klasse von Substanzen, die seit langem zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen einge- setzt werden. Die Einarbeitung von Wirkstoffen aus dieser Klasse in liposomale Formulierungen ist konzeptionell be- kannt und mehrfach beschrieben. Dabei ist die Formulierung der unmodifizierten Arzneiform schwierig, da liposomal ein- geschlossenes Material innerhalb von wenigen Stunden wieder freigesetzt wird. Die bekannten Strategien werden im Fol- genden kurz mit Beispielen referiert : Lipophile Derivatisierung zum Einbau in die Liposomenmem- bran : Die DE 27 120 30 (ICI 1977) ist ein frühes Beispiel, dass lipophil substituierte Glucocorticoide, beispielsweise Dexamethasonpalmitat, sich stabil in Liposomen einschließen lassen (auch : Mizushima et al. 1982, Yokoyama et al. 1985, Bonanomi et al. 1987). Nachteilhaft an diesen Formulie- rungen ist der Austausch des hydrophoben Wirkstoffderivats mit Plasmabestandteilen und eine geringe in vivo-Stabilität der Formulierungen. PEG-Liposomen : Eine Verbesserung demgegenüber wird in der WO 94/07466 (Liposome Technology) offenbart. Durch die Ver- wendung von PEG (Polyethylenglykol) -modifizierten Lipiden lässt sich die in vivo-Stabilität der Formulierung erhöhen und insbesondere die Zirkulationszeit der Liposomen ver- längern. Konzeptionell zielt diese Verbesserung darauf, den unspezifischen Verlust von eingebrachten Liposomen im reti- kuloendothelialen System zu vermindern und dadurch die spe- zifische Extravasierung von Liposomen an den Entzündungs- herden zu ermöglichen oder zu verbessern. Wasserlösliche Glucocorticoide können passiv in Liposomen eingeschlossen werden. Derivate wie Phosphatester, Aceto- nidphosphate und/oder Succinate sind dazu geeignet. Neuere Entwicklungen wie die EP 1 046 394 (Terumo Corp) und die WO 02/45688 (Gerrit Storm) gehen diesen Weg, wobei die was- serlöslichen Glucocorticoide in PEG-modifizierten Liposomen eingschlossen werden (siehe auch : Storm & Richmond 2001, Metselaar et al. 2002, Hussein et al. 2002). Cyclodextrin-Komplexe mit Glucocorticoiden sind eine andere Möglichkeit, ein wasserlösliches Derivat zu schaffen, wel- ches auf üblichem Weg in Liposomen eingebracht werden kann (Loftsson & Stefansson, 2002, Yano et al. 2002, WO 95/15746 (Gregoriadis)). Weiterhin sind in der WO 99/15150, der WO 99/55314 und EP 1 190 707 Liposomen offenbart, die wasserlösliche Gluco- corticoide enthalten. Der Stand der Technik hat den Nachteil, dass die erzielten Verbesserungen im Zirkulationsverhalten im Wesentlichen nur bei der erstmaligen Gabe der Formulierung erreicht werden können. Bei mehrmaliger Gabe von PEG-modifizierten Lipo- somen wird die Bildung von Antikörpern nachgewiesen. Deren Bindung führt bei wiederholter Anwendung zu einer Verringe- rung der Zirkulationshalbwertszeit und ist pharmakologisch unerwünscht (Dams et al. 2000). Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, liposomale Formu- lierungen von Glucocorticoiden bereitzustellen, die die ge- nannten Nachteile vermeiden und eine vorteilhafte Wirkung gegenüber dem freien Wirkstoff aufweisen. Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch die Bereit- stellung einer liposomalen Formulierung, die in einer in- neren wässrigen Phase wasserlösliche Glucocorticoide auf- weist und kein amphiphil modifiziertes Polyethylenglykol umfasst sowie in tierischem oder menschlichem Blutserum über Stunden stabil ist. Über Stunden stabil heißt im Sinne der Erfindung, dass die Formulierung mindestens eine, bevorzugt zwei, besonders bevorzugt drei bis vier Stunden und ganz besonders bevorzugt über fünf bis 24 Stunden stabil im Serum ist. Überraschenderweise sind die erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen über einen langen Zeitraum im Serum von Organismen anders als die bekannten Strukturen stabil. Das Merkmal der Stabilität ist daher anmeldungsgemäß nicht als Aufgabe an den Fachmann zu verstehen, sondern es dient allein der Klarstellung dahingehend, dass die beschriebenen erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen dieses Merkmal aufweisen. Die erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen bzw. Liposomen sind im Wesentlichen frei von konjugierten Polymeren, insbesondere frei von PEG, PEG- Phosphatidylethanolamin, PEG-Phosphatidylglycerol, PEG-Phosphatidylserin und/oder PEG-Cholesterol bzw. anderen amphiphil modifizierten Polyethylenglykolen. Überraschend wurde festgestellt, dass liposomale Zubereitungen von Glucocorticoiden, die ohne den Zusatz von PEG-Lipiden hergestellt werden, bei systemischer Anwendung hinreichend stabil sind und eine sehr vorteilhafte Wirkung gegenüber dem freien Glucocorticoid aufweisen, so dass ein besserer therapeutischer Effekt mit einer geringeren Dosis erzielt werden kann. Die erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen, liposomalen Zubereitungen bzw. Liposomen können demgemäß in verschiedenen Bereichen der Diagnose, Prophylaxe und Therapie eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Strukturen können bevorzugt zur Therapie von entzündlichen Krankheiten eingesetzt werden. Eine bevorzugte Auswahl der Indikationen von Glucocorticoiden ist : - schwere allergische und anaphylaktische Reaktionen, - anaphylaktischer Schock, Status asthmaticus, schwere Zustände bei Asthma bron- chiale, Hirnödem, Schädel-Hirn-Trauma, Hirnabszess, bakterielle Meningitis, Parenterale Anfangsbehandlung akuter schwerer Haut- erkrankungen, (Erythrodermie, Pemphigus vulgaris, akute Ekzeme), schwere Infektionserkrankungen, Nebennierenrinden- Insuffizienz, idiopathische retroperitoneale Fibrose, Morbus Addison, Adrenogenitales Syndrom, chronisch aggressive Hepatitis, Lymphogranulomatose, Differentialdiagnose von Morbus Cushing, primäre chronische Polyarthritis (rheumatoide Arthri- tis), chronische Polyarthritis, juvenile Arthritiden (Still-Syndrom), akute rheumatische Karditis, Arthrosen, aktivierte Arthrose, akute Form der Periarthropathia humeroscapularis, nichtbakterielle Tendovaginitis und Bursitis, Periarthropathien, Insertionsendopathien, Psoriasis- Arthritis, Spondylitis ankylosans (Morbus Bechterew), Spondylarthrosen mit Synovitis (aktivierte Arthrose), Spondylosen, Riesenzellarteriitis, Morbus Wegener, Churg-Strauß- Syndrom, mikrosk. Polyangiitis, nichtinfektiöse Keratokonjunktivitis, Skleritis, Iridozyklitis, Uveitis, Kollagenosen (system. Lupus erythematods (vor allem Nephritis), Panarteriitis nodosa, Dermatomyositis, primäres Sjögren-Syndrom), -akute Schübe von Morbus Crohn, schwere Schübe von Colitis ulcerosa (zum Beispiel toxisches Colon), - Multibles Myelom, - PFAFA-Syndrom (periodisches Fieber bei Kindern), - idiopathische retroperitoneale Fibrose (Morbus Ormond), -Multiple Sklerose, akute Myasthenia gravis-Krise, angio- neurotische Ödeme (zum Beispiel Quincke-Syndrom) und/oder - akute Alveolitis. Selbstverständlich ist es möglich, verschiedene wasserlös- liche Glucocorticoide einzusetzen. Der Einsatz der verwen- deten Glucocorticoide richtet sich insbesondere nach den unterschiedlichen Applikationsrouten. Systemisch applizier- te Glucocorticoide sind bevorzugt : Betamethason, Beta- methasondihydrogenphosphat-Dinatrium, Budesonid, Clopred- nol, Cortison, Cortisonacetat, Deflazacort, Dexamethason, Dexamethasondihydrogenphosphat-Dinatrium, Fluocortolon, Hydrocortison, Methylprednisolon, Prednisolon, Prednison, Prednyliden, Rimexolon und/oder Triamcinolon. Dermal werden bevorzugt appliziert : Alclometason, Amcino- nid, Betamethason, Clobetasol, Clobetason, Clocortolon, Desonid, Desoximethason, Dexamethason, Diflorason, Diflucortolon, Fludroxycortid, Flumethason, Flucinolon, Flucinonid, Fluocortin, Fluocortolon, Fluorometholon, Flupredniden, Fluticason, Halcinonid, Halomethason, Hydo- cortison, Methylprednisolon, Mometason, Prednicarbat, Prednisolon und/oder Triamcinolon. Bevorzugt werden im Zusammenhang mit der Erfindung die systemisch applizierten Glucocorticoide, ausgewählt aus obiger Liste, in einer wasserlöslichen Form eingesetzt. Dem Fachmann bekannte wasserlösliche Formen sind Salze und Ester der genannten Wirkstoffe, wie insbesondere die Phosphatester, Sulfatester oder die Dicarbonsäureester oder Additionssalze oder die Glycoside der Wirkstoffe. Es werden bevorzugt die Mono-oder Disalze eingesetzt, ganz besonders bevorzugt die Natrium-oder Kaliumsalze der Glucocorticoidphosphate, die-acetonidphosphate oder - succinate. Besonders bevorzugte Verbindungen aus dieser Gruppe sind Betamethasondihydrogenphosphat-Dinatrium, Dexamethason- phosphat, Dexamethasondihydrogenphosphat-Dinatrium, Predni- solonphosphat, Methylprednisolonphosphat, Prednisolon- succinat, Methylprednisolonsuccinat, Bemethasonphosphat, Desonidphosphat, Hydrocortisonphosphat, Hydrocortison- succinat, Prednisolatmahydrochlorid, Prednisonphosphat und/oder Triamcinoloneacetonidphosphat. Ganz besonders bevorzugte Verbindungen aus dieser Gruppe sind Dexamethasonphosphat, Dexamethasondihydrogenphosphat- Dinatrium und/oder Triamcinoloneacetonidphosphat. Die bevorzugten erfindungsgemäßen Verbindungen können be- sonders gut gegen inflammatorische Erkrankungen eingesetzt werden. Der Einsatz der erfindungsgemäßen liposomalen For- mulierungen führt zu Vorteilen und Verbesserungen gegenüber den bekannten liposomalen Formulierungen, insbesondere zu einer erhöhten Zuverlässigkeit und Qualitätshebung und größeren Effektivität in der Prophylaxe und Therapie der genannten Erkrankungen. Demgemäß wird durch die erfindungs- gemäßen Liposomen der Arzneimittelschatz bereichert und es werden die prophylaktischen und therapeutischen Möglich- keiten der Behandlung verschiedener Erkrankungen vermehrt. Da die erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen eine bessere Wirkung gegenüber dem freien Wirkstoff zeigen, kann dieser in einer niedrigeren Dosis angewendet werden, was zu einem verringerten Nebenwirkungsspektrum führt, ein nicht zu überschätzender Vorteil bei der Therapie mit Glucocorticoiden. Außerdem führt eine Dosisverringerung zu einer Ersparnis an Material, Kosten und schwer zu beschaf- fenden Feinchemikalien und pharmazeutischen Mitteln. Mit den erfindungsgemäßen Strukturen wird somit ein seit langem ungelöstes dringendes Bedürfnis befriedigt. Dem Fachmann sind Liposomen bekannt, die er einsetzen muss, um eine möglichst große Serumstabilität zu erreichen und die Bildung von Aggregaten zu verhindern. Besonders be- vorzugt werden Liposomen mit einer Größe zwischen 150 nm und 500 nm verwendet. Liposomen dieser Art sind dem Fachmann bekannt und umfassen auch Liposomen, die aus gesättigten Phospholipiden und Cholesterol aufgebaut sind. In einer bevorzugten Ausführung der erfinderischen Lehre werden zum Aufbau der Liposomen die folgenden Lipide eingesetzt : Dipalmitoylphosphytidyl- cholin, Distearoylphosphytidylcholin, Dipalmitoylphosphati- dylglycerol, Distearoylphosphatidylglycerol, Dipalmitoyl- phosphatidylserin, Distearoylphosphatidylserin, Choleste- rol. Unter den Mischungen dieser Substanzen sind solche bevor- zugt, die einen Anteil negativer Ladungsträger von nicht mehr als 20 mol% aufweisen. Weiter bevorzugt sind solche Mischungen, bei denen der Anteil negativer Ladungsträger zwischen 5 und 15 mol% liegt. Phosphatidylglycerole und Phosphatidylserine sind negative Ladungsträger in solchen Membranen. Die erfindungsgemäß bevorzugten Mischungen von Lipiden um- fassen bevorzugt solche, die entweder kein Cholesterol oder zwischen 35 und 50 mol% Cholesterol enthalten. Ganz beson- ders bevorzugt sind Liposomen, die zwischen 35 und 45 mol% Cholesterol enthalten. PH-sensitive Liposomen sind ebenfalls bekannt und umfassen insbesondere Cholesterolhemisuccinat (CHEMS), da dessen Carboxylgruppe durch unterhalb von pH 5 mehr und mehr entladen wird. Mit Vorteil wird dieses Lipid in Verbindung mit Phosphatidylethanolamin verwendet. Solche Liposomen mit einem Gehalt von 35 bis 50 mol% CHEMS und 65 bis 50 mol% Phosphatidylethanolamin sind bei neutralem pH-Wert stabil und zerfallen bei einem pH-Wert unterhalb von 5, wie er etwa bei der endosomalen Aufnahme erreicht wird. Anstelle des CHEMS kann auch ein anderes pH-sensitives Lipid eingesetzt werden, beispielweise Phosphatidylserin. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführung der Erfin- dung werden amphotere Liposomen verwendet. Ein besonderes Merkmal dieser Liposomen ist, dass deren Oberflächenladung sich mit dem pH-Wert der Umgebung ändert, von kationisch im sauren zu anionisch im basischen pH-Bereich. Die WO 02/066012 beschreibt pH-sensitive amphotere Lipo- somen, deren amphoteres Verhalten durch die gleichzeitige Anwesenheit von kationischen und anionischen Ladungsträgern in der Membran bestimmt ist und sich durch geeignete Aus- wahl und Verhältnisse der Komponenten variieren lässt. Als negativer Ladungsträger von amphoteren Liposomen nach WO 02/066012 werden bevorzugt natürliche Lipide eingesetzt, insbesondere : Dipalmitoylphosphatidylglycerol, Distearoyl- phosphatidylglycerol, Dipalmitoylphosphatidylserin, Di- stearoylphosphatidylserin, aber auch synthetisch herge- stellte Lipide, wie beispielsweise Cholesterolhemisuccinat oder CHEMS, Diacylglycerolhemisuccinate. Als kationischer Ladungsträger von amphoteren Liposomen nach WO 02/066012 können Lipide verwendet werden, bevor- zugt : DC-Chol 3-ß-[N-(N, N-dimethylethane) carbamoyl] choleste- rol, TC-Chol 3-ß-[N-(N, N, N-trimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol, BGSC Bis-guanidinium-spermidine-cholesterol, BGTC Bis-guanidinium-tren-cholesterol, DOTAP (1, 2-dioleoyloxypropyl) -N, N, N-trimethylammonium- chlorid, DOSPER (1, 3-dioleoyloxy-2- (6-Carboxy-spermyl)-propylamid), DOTMA (1, 2-dioleyloxypropyl) -N, N, N-trimethylammonium- chlorid) (Lipofectin&commat;), DORIE (1, 2-dioleyloxypropyl) -3 dimethylhydroxyethyl ammoniumbromid), DOSC (1, 2-dioleoyl-3-succinyl-sn-glycerl cholinester), DOGSDSO (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-succinyl-2hydroxyethyl disulfide ornithin), DDAB Dimethyldioctadecylammonium bromid, DOGS ((C18) 2GlySper3+) N, N-dioctadecylamido-glycyl-spermin (Transfectam&commat;), (C18) 2Gly+ N, N-dioctadecylamido-glycin, CTAB Cetyl-trimethylammoniumbromid, CPyC Cetyl-pyridiniumchlorid, DOEPC 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin oder andere O-Alkyl-Phosphatidylcholin oder-ethanolamine und/oder Amide aus Lysin, Arginin oder Ornithin und Phosphatidyl- ethanolamin. Auch pH-sensitiv positive Ladungsträger können Bestandteile von amphoteren Liposomen nach WO 02/066012 sein. Es werden bevorzugt Lipide verwendet, wie sie beispielsweise in der WO 02/066490 und WO 03/070220 offenbart sind, beispiels- weise 4- (2-Aminoethyl)-Morpholino-Cholesterolhemisuccinat und/oder Histaminyl-Cholesterolhemisuccinat. In einer bevorzugten Ausführung der erfinderischen Lehre wird zum Aufbau der amphoteren Liposomen eine Lipidmatrix mit neutralen Gerüstlipiden aufgebaut, die folgende Lipide miteinschließt : Dimyrystoylphosphytidylcholin, Dipalmitoylphosphytidyl- cholin, Palmitoyloleoylphosphatidylcholin, Distearoyl- phosphytidylcholin, Cholesterol, sowie gereinigte Cholin- fraktionen natürlichen Ursprungs wie Soja-Phosphatidyl- cholin oder, Ei-Phosphatidylcholin. Die WO 02/066489 beschreibt amphotere Liposomen, deren amphoteres Verhalten durch amphotere Ladungsträger in der Membran bestimmt wird, die sich vom Cholesterol ableiten, wie beispielsweise Na-Histidinyl-Cholesterol-hemisuccinat. Die WO 03/070735 beschreibt Komponenten für weitere pH-sen- sitive Liposomen dieser Art. Bevorzugt weisen die liposomalen Formulierungen vorteilhaf- te Mischungsverhältnisse auf. Unter den Mischungen dieser Substanzen sind solche bevorzugt, die einen Anteil negati- ver Ladungsträger von nicht mehr als 40 mol% aufweisen. Insbesondere bevorzugt sind solche Mischungen, bei denen der Anteil negativer Ladungsträger zwischen 5 bis 30 mol% liegt. Unter den Mischungen dieser Substanzen sind solche bevor- zugt, die einen Anteil positiver Ladungsträger von nicht mehr als 40 mol% aufweisen. Insbesondere bevorzugt sind solche Mischungen, bei denen der Anteil positiver Ladungs- träger zwischen 5 und 30 mol% liegt. Der molare Anteil an der Zusammensetzung der Liposomen- membran beträgt bei den Gerüstlipiden bevorzugt 30 bis 80 %, besonders bevorzugt 40 bis 70 %. Die erfindungsgemäß bevorzugten Mischungen von Lipiden um- fassen bevorzugt solche, die entweder kein Cholesterol oder zwischen 35 und 50 mol% Cholesterol enthalten. Ganz be- sonders bevorzugt sind Liposomen, die zwischen 35 und 45 mol% Cholesterol enthalten. Werden amphotere. Lipide zur Bildung der Liposomen eingesetzt, so beträgt der molare Anteil weniger als 40 mol%, bevorzugt 5-30 mol %. Solche amphoteren Liposomen sind für die Ausführung der Er- findung besonders bevorzugt, da sie im Serum stabil sind und keine Aggregate bilden. Der Offenbarungsgehalt der zu- gehörigen Referenzen, der WO 02 066012, WO 02 066490, WO 02 066489, WO 03 070220, WO 03 070735 werden in die Offenbarung der Beschreibung aufgenommen. Die Methoden zur Herstellung der wirkstoffhaltigen Liposo- men sind dem Fachmann bekannt und können aus Standardwerken entnommen werden. Mit besonderem Vorteil werden die Lipide in einem pharma- kologisch akzeptablen Alkohol wie Ethanol, Isopropanol oder 1,2-Propandiol oder auch in DMSO gelöst und unter schnellem Mischen in die wässrige Lösung des Wirkstoffes verdünnt. Bei geeigneter Prozessführung, beispielsweise bei einer 10-fachen Verdünnung der organischen in die wässrige Phase, entstehen Liposomen im gewünschten Größenbereich zwischen 150 und 500 nm. Es ist dann keine weitere Veränderung der Liposomen durch Homogenisation oder Extrusion notwendig. Nicht eingeschlossener Wirkstoff kann abgetrennt werden. Dazu eignen sich Verfahren wie Gelfiltration, Zentrifuga- tion oder auch Dialyse, besonders Tangentialflussdialyse. Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Mittel, die die erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen umfassen. Die erfindungsgemäßen Liposomen werden in einer pharmazeuti- schen Zubereitung formuliert. Diese umfasst die Verwendung und/oder Zumischung von Hilfsstoffen (Stabilisatoren, Anti- oxidantien), die eine gute Verträglichkeit, pharmazeutische Sicherheit und Herstellung und Lagerung unter GMP-Be- dingungen sicherstellen. Dazu gehört beispielsweise die Verwendung von sterilen Salz-, Puffer-und/oder Zucker- lösungen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden in einer thera- peutischen Menge mit einem Organismus in Kontakt gebracht ; in solch einem Falle werden die erfindungsgemäßen Ver- bindungen als pharmazeutisches Mittel oder als Arzneimittel eingesetzt ; demgemäß können diese Begriffe im Kontext der Erfindung synonym verwendet werden. Der Ausdruck thera- peutische Menge bezeichnet wie hierin verwendet eine Menge, die Symptome einer Störung oder responsiven, pathologisch physiologischen Kondition verhindert oder verbessert. In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist die verabreichte Menge ausreichend, eine Entzündung zu verhindern oder zu hemmen. Die Erfindung betrifft demgemäß - wie bereits ausgeführt-pharmazeutische Mittel oder Arz- neimittel, die die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutischen Hilfsstoffen. Die an einem Gesunden im Falle der Prophylaxe bzw. an einem Patienten im Falle der Therapie zu verwendende Menge an erfindungsgemäßen Verbindungen wird formuliert und die Do- sis gemäß üblicher medizinischer Praxis festgesetzt, wobei die zu behandelnde Störung, der Zustand des einzelnen Patienten, die Verabreichungsstelle, das Verabreichungsver- fahren und andere den behandelnden Ärzten bekannte Faktoren berücksichtigt werden. In ähnlicher Weise hängt die Dosis der verabreichten erfindungsgemäßen Verbindungen von den Eigenschaften der Entzündung ab, von der in vivo Halb- wertszeit erfindungsgemäßen Verbindungen im Plasma wie auch von der Konzentration der erfindungsgemäßen Verbindungen in der Formulierung, dem Verabreichungsweg, der Stelle und der Rate der Dosierung, der klinischen Toleranz des jeweiligen Individuums (Mensch und Tier), der pathologischen Affektion des Patienten und dergleichen, wie es Ärzten bzw. anderen Fachleuten bekannt ist. Es können während einer Abfolge aufeinander folgender Verabreichungen auch unterschiedliche Dosierungen eingesetzt werden. Es ist zum Beispiel vorgesehen, dass Injektionen (intra- muskulär oder subkutan oder in die Blutgefäße) ein Weg für die therapeutische Verabreichung der erfindungsgemäßen Ver- bindungen, beispielsweise der eingekapselten oder an Träger gebundenen erfindungsgemäßen Verbindungen, sind, obgleich die Zufuhr als Aerosol, über Katheter oder chirurgische Schläuche auch angewendet werden kann. Andere bevorzugte Wege umfassen im Handel erhältliche Vernebler für flüssige Formulierungen und Inhalationen von lyophilisierten oder aerolysierten Verbindungen und Suppositorien für rektale oder vaginale Verabreichung. Die Eignung der gewählten Parameter, zum Beispiel Dosis, Schema, Adjuvanzwahl und dergleichen, kann durch Entnahme von Serum-Aliquoten aus dem Patienten-das heißt dem Mensch oder dem Tier-und Testen im Verlauf der Applikationen bestimmt werden. Alternativ und begleitend dazu kann die Menge von T-Zellen oder anderen Zellen des Immunsystems auf herkömmliche Weise bestimmt werden, um einen Gesamtüberblick über die Entzündung des Patienten zu erhalten. Zusätzlich kann der klinische Zustand des Patienten auf die gewünschte Wirkung hin beobachtet werden. Da Entzündungen mit anderen Erkrankungen assoziiert sein können, ist es auch möglich, diese zusätzlich mit zu verfolgen. Im Allgemeinen können sowohl wässrige Formulierungen als auch trockene erfindungsgemäße Verbindungen mit einem Exzipienten vermengt werden, um für eine stabilisierende Wirkung vor der Behandlung beispielsweise mit einem Lö- sungsmittel zu sorgen. Eine wässrige Lösung einer erfin- dungsgemäßen Verbindung kann eine erfindungsgemäße Verbin- dung in Suspension oder eine Lösung sein. Dem Fachmann sind weitere Zubereitungs-, Darreichungs-und Anwendungsformen bekannt, wie zum Beispiel als Gel, Emulsion, Aufgussformu- lierung, Tropfen, Konzentrat, Sirup, Boli, Aerosol, Spray und/oder Inhalat. Die Behandlung der Entzündungen umfasst Prophylaxe, Prävention, Diagnose, Verminderung, Therapie, Verlaufskontrolle und/oder Nachbehandlung. Die erfindungsgemäße Verbindung kann in einer Lösung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Konservierungsmittel ein- gebracht sein. Beispiele für geeignete Konservierungsmittel der Suspension bzw. Lösungen umfassen Phenol, Benzyl- alkohol, m-Kresol, Metylparaben, Propylparaben, Benz- alkoniumchlorid und Benzethoniumchlorid in einer solchen Konzentration, dass die konservierende Wirkung eintritt, ohne dass die liposomale Formulierung nachteilig modi- fiziert wird. Im Allgemeinen können die Formulierungen der erfindungsgemäßen Verbindungen Komponenten in Mengen ent- halten sein, die der Herstellung stabiler Formen nicht ab- träglich sind und in Mengen, die für wirksame, sichere pharmazeutische Verabreichungen geeignet sind. Beispiels- weise können andere pharmazeutisch annehmbare, dem Fach- kundigen bekannte Exzipienten einen Teil der erfindungs- gemäßen Verbindungen oder Formulierungen bilden. Diese umfassen beispielsweise Salze, verschiedene Füller, zusätz- liche Pufferagenzien, Chelatbildner, Antioxydanzien, Co- Lösungsmittel und dergleichen. Dem Fachmann ist bekannt, dass künstliche bzw. natürliche Membranen von Liposomen eine immunstimulierende Wirkung haben können, insbesondere dann, wenn die Komponenten auf die Oberfläche der Liposomen gekoppelt werden oder im In- neren der Liposomen eingeschlossen sind oder einfach nur mit den Liposomen zusammen vermischt werden. Derartige For- mulierungen von Liposomen können zum Beispiel zusammen mit den erfindungsgemäßen Liposomen parentral appliziert wer- den ; selbstverständlich ist es auch möglich, die erfin- dungsgemäßen Liposomen so zu modifizieren, dass sie eine immunstimulierende Wirkung haben. Es ist möglich, derartige Formulierungen mit bekannten Methoden, wie zum Beispiel einem Spray, nasal auf die Schleimhäute zu applizieren. Eine mit dem Spray vorgenommene therapeutische Behandlung ist bevorzugt für die Behandlung von Entzündungen im Hals- Nasen-Ohren Bereich geeignet. Die liposomale Zusammen- setzung, die zusammen mit der erfindungsgemäßen Zusammen- setzung appliziert ist, kann einen oder mehrere zusätzliche pharmazeutische Träger umfassen, die ausgewählt sind aus oberflächenaktiven Stoffen und Absorptionsförderern wie zum Beispiel Gallensalzen und deren Derivaten, Fusidinsäure und deren Derivaten, Oleinsäure, Lecithin, Lysolecithinen usw., wasserabsorbierenden Polymeren wie zum Beispiel Glycofurol, Polyvinylpyrrolidon, Propylenglycol oder Polyacrylsäure, Gelatine, Cellulose und Derivaten usw. ; Substanzen, welche den enzymatischen Abbau hemmen, wie zum Beispiel Aprotinin usw. ; organischen Lösungsmitteln wie zum Beispiel Alko- holen, zum Beispiel Ethanol, Glycerol, Benzylalkohol usw. ; oder Ethylacetat usw. ; hydrophoben Mitteln wie zum Beispiel pflanzlichem Öl, Sojabohnenöl, Erdnussöl, Kokosnussöl, Maisöl, Olivenöl, Sonnenblumenöl, "Miglyolen"oder deren Mischungen usw. ; pH-regulierenden Mitteln wie zum Beispiel Salpetersäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Citraten usw. ; Konservierungsmitteln und den osmotischen Druck regulieren- den Mitteln wie zum Beispiel Glycerol, Natriumchlorid, Methylparaoxybenzoat, Benzoesäure usw. ; Liposomen-und/oder Emulsionsformulierungen wie zum Beispiel Lecithinen usw. ; mikroverkapselten Formulierungen ; Treibmitteln wie zum Bei- spiel Butan. Bei den Trägern, die Bestandteil von Arzneimitteln sein können-die die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen-, kann es sich im Sinne der Erfindung auch um Wasser-Öl- Emulsionen wie beispielsweise Montanide, Polylysin, Poly- arginin-Verbindungen oder andere, wie zum Beispiel phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, Wasser, sterile Lösungen und dergleichen mehr. Das pharmazeutische Mittel im Sinne der Erfindung kann neben den Glucocorticoiden beispielsweise ein akzeptables Salz oder Komponenten dieser umfassen. Hierbei kann es sich beispielsweise um Salze anorganischer Säuren handeln wie zum Beispiel der Phosphorsäure bzw. um Salze organischer Säuren. Weiterhin ist es möglich, dass die Salze frei von Carboxylgruppen sind und von anorganischen Basen abgeleitet wurden wie zum Beispiel Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium oder Eisenhydroxyde oder auch von organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin und andere. Beispiele für flüssige Träger sind sterile wässrige Lösungen, die keine weiteren Materialien oder aktiven Ingredienzien umfassen und beispielsweise Wasser oder solche, die einen Puffer wie zum Beispiel Natrium- phosphat mit einem physiologischen pH umfassen oder eine physiologische Salzlösung bzw. beides, wie zum Beispiel phosphatgepufferte Natriumchloridlösung. Weitere flüssige Träger können mehr als nur ein Puffersalz, wie zum Beispiel Natrium-und Kaliumchlorid, HEPES, Dextrose, Propylenglycol oder andere umfassen. Flüssige Zusammensetzungen der pharmazeutischen Mittel können zusätzlich eine flüssige Phase, jedoch unter dem Ausschluss von Wasser, umfassen. Beispiele solcher zusätzlichen flüssigen Phasen sind Glycerin, Pflanzenöle, organische Ester oder Wasser-Öl- Emulsionen. Die pharmazeutische Zusammensetzung bzw. das pharmazeutische Mittel enthält typischerweise einen Gehalt von mindestens 0,01 Gew% der erfindungsgemäßen Verbindungen bezogen auf die gesamte pharmazeutische Zusammensetzung. Die jeweilige Dosis bzw. der Dosisbereich für die Gabe des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittels ist groß genug, um den gewünschten prophylaktischen oder therapeutischen Effekt zu erreichen. Hierbei sollte die Dosis nicht so gewählt werden, dass unerwünschte Nebeneffekte dominieren. Im Allgemeinen wird die Dosis mit dem Alter, der Konstitu- tion, dem Geschlecht des Patienten variieren sowie selbst- verständlich auch in Bezug auf die Schwere der Erkrankung. Die individuelle Dosis kann sowohl in Bezug auf die primäre Erkrankung als auch in Bezug auf Eintreten zusätzlicher Komplikationen eingestellt werden. Die exakte Dosis ist durch einen Fachmann mit bekannten Mitteln und Methoden feststellbar, beispielsweise durch die Feststellung des Tumorwachstums in Abhängigkeit der Dosis bzw. in Abhängig- keit des Applikationsschemas oder der pharmazeutischen Trä- ger und ähnlichem. Die Dosis kann hierbei je nach Patient individuell gewählt werden. Beispielsweise kann eine vom Patienten noch tolerierte Dosis des pharmazeutischen Mit- tels eine solche sein, deren Bereich im Plasma oder in einzelnen Organen lokal im Bereich von 0,1 bis 10000 ßM liegt, bevorzugt zwischen 1 und 100 yM, wobei sich die Dosis auf das pharmazeutische Mittel, die liposomale For- mulierung oder die Glucocorticoide beziehen kann. Alter- nativ kann die Dosis auch in Bezug auf das Körpergewicht des Patienten bezogen berechnet werden. Weiterhin ist es jedoch auch möglich, die Dosis nicht in Bezug auf den gesamten Patienten, sondern in Bezug auf einzelne Organe zu bestimmen. Dies wäre beispielsweise dann der Fall, wenn das erfindungsgemäße pharmazeutische Mittel beispielsweise in einem Biopolymer, eingebracht in den jeweiligen Patienten, in der Nähe bestimmter Organe mittels einer Operation platziert wird. Dem Fachmann sind mehrere Biopolymere bekannt, die Liposomen in einer gewünschten Art und Weise freisetzen können. In solch einem Fall wird das thera- peutische Mittel als feste, gelartige oder als flüssige Komposition verabreicht. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Träger ausgewählt aus der Gruppe umfassend Füll- mittel, Streckmittel, Bindemittel, Feuchthaltemittel, Sprengmittel, Lösungsverzögerer, Resorptionsbeschleuniger, Adsorbtionsmittel, und/oder Gleitmittel, die so ausgewählt sind, dass sie die erfindungsgemäße liposomale Formulierung nicht beeinträchtigen. Hierbei handelt es sich bei den Füll-und Streckmitteln be- vorzugt um Stärken, Milchzucker, Rohrzucker, Glukose, Man- nit und Kieselsäure, bei dem Bindemittel, bevorzugt Car- bocymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrroli- don, bei dem Feuchthaltemittel bevorzugt um Glycerin, bei dem Sprengmittel bevorzugt um Agar-Agar, Calciumcarbonat und Natriumcarbonat, bei dem Lösungsverzögerer vorzugsweise um Paraffin und bei dem Resorptionsbeschleuniger bevorzugt um quarternäre Ammoniumverbindungen, bei dem Adsorptionsmittel bevorzugt um Kaolin und Bentonit und bei dem Gleitmittel bevorzugt um Talkum, Calcium-und Magnesiumstearat oder Gemische der aufgeführten Stoffe. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen als Gel, Emulsion, Aufgussformulierung, Tropfen, Konzentrat, Sirup, Boli, Aerosol, Spray und/oder Inhalat zubereitet und/oder in dieser Form angewendet. Der oder die Wirkstoffe-das heißt die erfindungsgemäßen Verbindungen-können gegebenenfalls mit einem oder mehre- ren der oben angegebenen Trägerstoffe auch in mikrover- kapselter Form vorliegen. Suppositorien können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen wasserlöslichen oder wasserunlöslichen Träger- stoffe enthalten, zum Beispiel Polyethylenglycole, Fette, zum Beispiel Kakaofett und höhere Ester (zum Beispiel C14- Alkohol mit Gig-Fettsäure) oder Gemische dieser Stoffe). Salben, Pasten, Cremes und Gele können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe enthalten, zum Bei- spiel tierische und pflanzliche Fette, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyethylenglycole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talkum und Zinkoxid oder Gemische dieser Stoffe. Sprays können zusätzlich die üblichen Treibmittel, zum Beispiel Chlorfluorkohlenwasserstoffe, enthalten. Lösungen und Emulsionen können neben dem oder den Wirk- stoffen die üblichen Trägerstoffe wie Lösungsmittel, Lösungsvermittler und Emulgatoren, zum Beispiel Wasser, Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butylen- glykol, Dimethylformamid, Öle, insbesondere Baumwollsaatöl, Erdnussöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Ricinusöl und Sesamöl, Glycerin, Glycerinformal, Tetrahydo-furfurylalkohol und Fettsäureester des Sorbitans oder Gemische dieser Stoffe enthalten. Zur parenteralen Applikation können die Lösungen und Emulsionen auch in steriler und blutisotonischer Form vorliegen. Suspensionen können neben dem oder den Wirkstoffen die üb- lichen Trägerstoffe wie flüssige Verdünnungsmittel, zum Beispiel Wasser, Ethylalkohol, Propylenglykol, Suspendier- mittel, zum. Beispiel ethoxilierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbit-und Sorbitan-Ester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant oder Gemische dieser Stoffe enthalten. Die Arzneimittel können in Form einer sterilen injizier- baren Zubereitung, zum Beispiel als sterile injizierbare wässrige oder liposomale Suspension, vorliegen. Diese Sus- pension kann auch im Fachgebiet bekannten Verfahren unter Verwendung geeigneter Dispergier-oder Netzmittel und Sus- pendiermittel formuliert werden. Die sterile injizierbare Zubereitung kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem ungiftigen parenteral verträglichen Verdünnungs-oder Lösungsmittel, zum Beispiel als Lösung in 1,3-Butandiol, sein. Zu den verträglichen Vehikeln und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, gehören Man- nit, Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchlorid- lösung. Die genannten Formulierungsformen können auch Färbemittel, Konservierungsstoffe sowie geruchs-und geschmacksverbes- serte Zusätze, zum Beispiel Süßmittel, zum Beispiel Saccha- rin, enthalten. Die erfindungsgemäßen Verbindungen. sollen in den aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen vorzugs- weise in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 99,5, vor- zugsweise von etwa 0,5 bis 95 Gew.-W der Gesamtmischung vorhanden sein. Die aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können außer den erfindungsgemäßen Verbindungen auch weitere phar- mazeutische Wirkstoffe enthalten. Die Herstellung der oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen erfolgt in üb- licher Weise nach bekannten Methoden, zum Beispiel durch Mischen des oder der Wirkstoffe mit dem oder den Träger- stoffen. Die genannten Zubereitungen können bei Mensch und Tier ent- weder oral, nasal, rektal, regional-zum Beispiel in Ge- lenkbereichen oder ähnliches-parenteral (intravenös, intramuskulär, subkutan), intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, lokal, dermal (Puder, Salbe, Tropfen) und zur Therapie von Entzündungen in Hohlräumen, Körperhöhlen angewendet werden. Als geeignete Zubereitung kommen Injek- tionslösungen, Lösungen und Suspensionen für die orale Therapie, Gele, Aufgussformulierungen, Emulsionen, Salben oder Tropfen in Frage. Zur lokalen Therapie können ophtal- mologische und dermatologische Formulierungen oder Lösungen verwendet werden. Bei Tieren kann die Aufnahme auch über das Futter oder Trinkwasser in geeigneten Formulierungen erfolgen. Ferner können Gele, Tabletten, Retard-Tabletten, Premixe, Konzentrate, Boli, Kapseln, Aerosole, Sprays, Inhalate bei Mensch und Tier angewendet werden. Ferner kön- nen die erfindungsgemäßen Verbindungen in andere Träger- materialien wie zum Beispiel Kunststoffe, (Kunststoffketten zur lokalen Therapie), Kollagen oder Knochenzement einge- arbeitet werden. Die Wirkstoffmenge, das heißt die Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung, die mit den Trägermaterialien kombiniert wird, um eine einzige Dosierungsform zu erzeugen, wird von dem Fachmann in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Wirt, von der zu behandelnden Entzündung und der besonderen Verabreichungsart variieren können. Nach Besserung des Zustandes eines Wirts bzw. eines Patienten kann der Anteil der wirksamen Verbindung in der Zubereitung so geändert werden, dass eine Erhaltungsdosis vorliegt.- Anschließend kann die Dosis oder Frequenz der Verabreichung oder beides als Funktion der Symptome auf eine Höhe verringert werden, bei der der verbesserte Zustand bei- behalten wird. Wenn die Symptome auf das gewünschte Niveau gelindert worden sind, sollte die Behandlung aufhören. Patienten können jedoch eine Behandlung mit Unterbrechung auf Langzeitbasis nach beliebigem Wiederauftreten von Erkrankungssymptomen benötigen. Demgemäß ist der Anteil der Verbindungen, das heißt ihre Konzentration, in der Gesamtmischung der pharmazeutischen Zubereitung ebenso wie ihre Zusammensetzung oder Kombination variabel und kann vom Fachmann aufgrund seines Fachwissens modifiziert und angepasst werden. Dem Fachmann ist bekannt, dass die erfindungsgemäßen Ver- bindungen mit einem Organismus, bevorzugt einem Menschen oder einem Tier, auf verschiedenen Wegen in Kontakt ge- bracht werden können. Weiterhin ist dem Fachmann bekannt, dass insbesondere die pharmazeutischen Mittel in verschie- denen Dosierungen appliziert werden können. Die Applikation sollte hierbei so erfolgen, dass die Entzündung möglichst effektiv bekämpft wird bzw. der Ausbruch einer solchen Krankheit in einer prophylaktischen Gabe verhindert wird. Die Konzentration und die Art der Applikation kann vom Fachmann durch Routineversuche eruiert werden. Bevorzugte Applikationen der erfindungsgemäßen Verbindungen sind die orale Applikation in Form von Saft, Tropfen, Kapseln oder ähnlichem, die rektale Applikation in Form von Zäpfchen, Lösungen und ähnlichem, parenteral in Form von Injektionen, Infusionen und Lösungen, Inhalation von Dämpfen und Aerosolen sowie lokal in Form von Salben, Pflastern, Umschlägen, Spülungen und ähnlichem. Bevorzugt erfolgt das In-Kontakt-Bringen der erfindungsgemäßen Verbindungen prophylaktisch oder therapeutisch. Bei einer prophylaktischen Gabe soll die Ausbildung der Entzündung zumindest dergestalt verhindert werden, dass eine weitere Entzündung stark vermindert wird oder nahezu vollständig eliminiert wird. Bei einem therapeutischen In-Kontakt- Bringen liegt bereits eine manifeste Entzündung des Patienten vor und die bereits im Körper vorhandenen Entzündungsherde sollen gehemmt werden. Weitere hierfür bevorzugte Applikationsformen sind beispielsweise die subkutane, die sublinguale, die intravenöse, die intra- muskuläre, die intraperitoneale und/oder die topische. Neben den bereits ausgeführten Konzentrationen bei der An- wendung der erfindungsgemäßen Verbindungen können in einer bevorzugten Ausführungsform die Verbindungen weiterhin in einer Gesamtmenge von 0,005 bis 500 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden eingesetzt werden, bevorzugt von 0.05 bis 100 mg/kg Körpergewicht. Hierbei handelt es sich vorteilhafterweise um eine therapeutische Menge, die verwendet wird, um die-Symptome einer Störung oder responsiven, pathologisch physiologischen Kondition zu verhindern oder zu verbessern. Die verabreichte Menge ist ausreichend, um die Entzündung zu hemmen. Selbstverständlich wird die Dosis vom Alter, der Gesundheit und dem Gewicht des Empfängers, dem Grad der Krankheit, der Art einer notwendigen gleichzeitigen Behandlung, der Häufigkeit der Behandlung und der Art der gewünschten Wir- kungen und der Nebenwirkungen abhängen. Die tägliche Dosis von 0,005 bis 500 mg/kg Körpergewicht kann einmalig oder mehrfach angewendet werden, um die gewünschten Ergebnisse zu erhalten. Die Dosishöhen pro Tag sind bei der Vorbeugung und bei der Behandlung anwendbar. Typischerweise werden insbesondere pharmazeutischen Mittel zur etwa 1-bis 10- maligen Verabreichung pro Tag oder alternativ oder zu- sätzlich als kontinuierliche Infusion verwendet. Sie können aber auch in Abständen von 2-10 Tagen verabreicht werden. Solche Verabreichungen können als chronische oder akute Therapie angewendet werden. Die Wirkstoffmengen, die mit den Trägermaterialien kombiniert werden, um eine einzelne Dosierungsform zu erzeugen, können in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Wirt und der besonderen Verabreichungsart selbstverständlich variieren. Bevorzugt ist es, die Tar- getsdosis auf 2 bis 5 Applikationen zu verteilen, wobei bei jeder Applikation 1 bis 2 Tabletten, Kapseln, Lösungen mit einem Wirkstoffgehalt von 0,05 bis 500 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden. Selbstverständlich ist es möglich, den Wirkstoffgehalt auch höher zu wählen, beispielsweise bis zu einer Konzentration bis 5000 mg/kg. Beispielsweise können Kapseln, die die erfindungsgemäßen Liposomen umfassen, auch retardiert sein, wodurch sich die Anzahl der Applikationen pro Tag auf 1 bis 3 vermindert oder es können mehrere Tage dazwischen liegen. Der Wirkstoffgehalt der retardierten Kapseln kann 3 bis 3000 mg betragen. Wenn der Wirkstoff-wie ausgeführt-durch eine Injektion verabreicht wird, ist es bevorzugt, 1-bis 10-mal pro Tag bzw. durch Dauerinfusion den Wirt mit den erfindungsgemäßen Verbindungen in Kontakt zu bringen, wobei Mengen von 0,04 bis 4000 mg pro Tag bevorzugt sind. Die bevorzugten Gesamt- mengen pro Tag haben sich in der Humanmedizin und in der Veterinärmedizin als vorteilhaft erwiesen. Es kann erfor- derlich sein, von den genannten Dosierungen abzuweichen und zwar in Abhängigkeit von der Art und dem Körpergewicht des zu behandelnden Wirts, der Art und der Schwere der Erkran- kung, der Art der Zubereitung der Applikation des Arznei- mittels sowie dem Zeitraum bzw. dem Intervall, innerhalb welchem die Verabreichung erfolgt. So kann es in einigen Fällen bevorzugt sein, den Organismus mit weniger als den genannten Mengen in Kontakt zu bringen, während in anderen Fällen die angegebene Wirkstoffmenge überschritten werden muss. Die Festlegung der jeweils erforderlichen optimalen Dosierungen und der Applikationsart der Wirkstoffe kann durch den Fachmann aufgrund seines Fachwissens leicht erfolgen. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Einzelgabe von 0,01 bis 80, insbesondere von 0,3 bis 40 mg/kg Körpergewicht eingesetzt. Wie auch die Gesamtmenge pro Tag kann auch die Menge der Einzelgabe pro Applikation von dem Fachmann aufgrund seines Fachwissens variiert wer- den. Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen können in den genannten Einzelkonzentrationen und Zubereitungen zu- sammen mit dem Futter bzw. mit Futterzubereitungen oder mit dem Trinkwasser auch in der Veterinärmedizin gegeben wer- den. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die erfindungsgemäßen Verbindungen mit mindestens einem anderen bekannten pharmazeutischen Mittel eingesetzt werden. Das heißt, die erfindungsgemäßen Verbindungen kön- nen in einer prophylaktischen oder therapeutischen Kombi- nation in Verbindung mit den bekannten Arzneimitteln ein- gesetzt werden. Diese Kombinationen können gemeinsam, zum Beispiel in einer einheitlichen pharmazeutischen Formu- lierung verabreicht werden, oder getrennt, zum Beispiel in Form einer Kombination aus Tabletten, Injektion oder an- deren Medikamenten, die zu gleichen oder zu unterschied- lichen Zeiten verabreicht werden, mit dem Ziel, die ge- wünschte prophylaktische oder therapeutische Wirkung zu erzielen. Bei diesen bekannten Mitteln kann es sich um Mittel handeln, die die Wirkung der erfindungsgemäßen Ver- bindungen steigern. Selbstverständlich ist es auch möglich, die erfindungs- gemäßen Verbindungen, insbesondere die pharmazeutischen Mittel, allein oder zusammen mit anderen Mitteln in einer Therapie, beispielsweise in einer Kombinationstherapie, als regionale Therapie einzusetzen. Selbstverständlich können die erfindungsgemäßen Verbin- dungen in Kombination mit anderen bekannten Anti- Entzündungsmitteln verwendet werden. Dem Fachmann sind der- artige Mittel bekannt. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können demgemäß mit allen herkömmlichen Mitteln, ins- besondere anderen Arzneimitteln, verabreicht werden, die für die Verwendung verfügbar sind, entweder als einzelne Arzneimittel oder in Kombination von Arzneimitteln. Sie können allein verabreicht werden oder in Kombination mit diesen. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in Substanz oder als wässrige Lösung vorliegen zusammen mit anderen Ma- terialen wie Konservierungsmitteln, Puffersubstanzen, Mit- teln die zur Einstellung der Osmolarität der Lösung vor- gesehen sind etc. Die Erfindung betrifft auch einen Kit und dessen Verwendung in der Medizin. Es ist bevorzugt, die erfindungsgemäßen Verbindungen oder den Kit, der diese umfasst, in einer Kombinationstherapie, insbesondere zur Behandlung von Ent- zündungen, zu verwenden. Die erfindungsgemäßen Liposomen finden Anwendung bei der systemischen Behandlung von inflammatorischen und Auto- immun-Erkrankungen mit Cortikoiden. Bevorzugte Indikationen sind die Autoimmunerkrankungen. Dazu gehören unter anderem die systemischen Vaskulitiden, Lupus erythematodes, Polymyositis, Polymyalgia rheumatica, rheumatisches Fieber, rheumatische rheumatoide Arthritis, systemische Sklerose, reaktive Arthritiden, Neurodermitis, Psoriasis, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Multiple Sklerose, Asthma bronchiale und andere mehr. Die erfindungsgemäßen Liposomen, pharmazeutischen Mittel und/oder der Kit können zur Prophylaxe oder Behandlung von pathogenen Modifikationen eingesetzt werden, bevorzugt von (i) Entzündungen, besonders bevorzugt von (ii) Autoimmun- erkrankungen, ganz besonders bevorzugt von (iii) Arthritis. (i) Entzündungen im Sinne der Erfindung sind die vom Binde- gewebe und den Blutgefäßen getragene Reaktion des Organis- mus auf einen äußeren oder innerlich ausgelösten Ent- zündungsreiz mit dem Zweck, diesen zu beseitigen oder zu inaktivieren und die reizbedingte Gewebsschädigung zu repa- rieren. Auslösend wirken mechanische Reize (Fremdkörper, Druck, Verletzung) und andere physikalische Faktoren (ioni- sierende Strahlen, UV-Licht, Wärme, Kälte), chemische Stof- fe (Laugen, Säuren, Schwermetalle, bakterielle Toxine, Allergene und Immunkomplexe) sowie Erreger (Mikroorganismen, Würmer, Insekten) bzw. krankhafte Stoffwechselprodukte, entgleiste Enzyme, bösartige Tumoren. Das Geschehen beginnt mit einer kurzen Arteriolenverengung (durch Adrenalin- wirkung) mit Mangeldurchblutung und Gewebsalteration, gefolgt von der Entwicklung der klassischen örtlichen Ent- zündungszeichen (Kardinalsymptome ; nach GALEN und CELSUS), das heißt von Rötung (= Rubor ; Gefäßerweiterung durch Histamin), Wärme (= Calor ; durch örtliche Stoffwechsel- steigerung), Schwellung (= Tumor ; durch Austritt eiweiß- reicher Flüssigkeit aus den-unter anderem durch Histamin-veränderten Gefäßwänden, unterstützt durch die verlangsamte Blutzirkulation im Sinne der Prästase bis Stase), Schmerz (= Dolor ; als Folge der erhöhten Gewebs- spannung und schmerzauslösender Entzündungsprodukte, zum Beispiel Bradykinin) und Funktionsstörung (= Functio laesa). Der Vorgang wird ergänzt durch Störung des Elektrolythaushaltes (Transmineralisation), Einwanderung neutrophiler Granulozyten und Monozyten durch die Gefäß- wände (s. a. Leukotaxis), letzteres mit dem Zweck, den Ent- zündungsreiz und geschädigte bis neukrotische Zellen zu beseitigen (Phagozytose) ; ferner wandern Lymphozyten-Effek- torzellen ein, die zur Bildung spezifischer Antikörper gegen den Entzündungsreiz führen (Immunreaktion), sowie Eosinophile (in der Heilungsphase bzw. -sehr frühzeitig- bei allergisch-hyperergischem Geschehen). Durch die bei der Reaktion erfolgende Aktivierung des Komplementsystems werden Bruchstücke (C3a und C5a) dieses Systems frei, die - wie das Histamin und Bradykinin-als Mediatoren der Entzündung wirken, und zwar im Sinne der Anregung der Chemotaxis der zitierten Blutzellen ; ferner wird die Blutgerinnung aktiviert. In der Folge tritt eine Schädigung (Dystrophie und Koagulationsnekrose) des zugeordneten Organparenchyms ein. Der Gesamtorganismus reagiert je nach Intensität und Art der Entzündung mit Fieber, Stress (s. a. Adaptationssyndrom), Leukozytose und Veränderungen in der Zusammensetzung der Plasmaproteine (Akute-Phase-Reaktion), die zu einer beschleunigten Blutkörperchensenkungsreaktion führen. Bevorzugte Entzündungen im Sinne der Erfindung sind die eitrige, die exudative, die fibrinöse, die gangränes- zierende, die granulomatöse, die hämorrhagische, die katarrhalische, die nekrotisierende, die proliferative oder produktive, die pseudomembranöse, die seröse, die spezi- fische und/oder die ulzeröse Entzündungen. (ii) Autoimmunerkrankungen im Sinne der Erfindung sind Krankheiten, die ganz oder teilweise auf die Bildung von Autoantikörpern und deren schädigende Einwirkung auf den Gesamtorganismus bzw. Organsysteme, das heißt auf Auto- aggression zurückzuführen sind. Eine Klassifikation ist als organspezifische, intermediäre und/oder systemische Auto- immunerkrankung möglich. Bevorzugte organspezifische Auto- immunerkrankungen sind HASHIMOTO Thyreoiditis, primäres Myxödem, Thyreotoxikose (BASEDOW Krankheit), perniziöse Anämie, ADDISON Krankheit, Myasthenia gravis und/oder juve- niler Diabetes mellitus. Bevorzugte intermediäre Auto- immunkrankheiten sind GOODPASTURE Syndrom, autoimmune hämo- lytische Anämie, autoimmune Leukopenie, idiopathische Thrombozytopenie, Pemphigus vulgaris, sympathische Ophthal- mie, primäre biliäre Zirrhose, Autoimmunhepatitis, Colitis ulcerosa und/oder SJÖGREN Syndrom. Bevorzugte systemische Autoimmunkrankheiten sind rheumatoide Arthritis, rheuma- tisches Fieber, systemischer Lupus erythematodes, Dermato- myositis/Polymyositis, progressive systemische Sklerose, WEGENER Granulomatose, Panarteriitis nodosa und/oder Hyper- sensitivitätsangiitis. Typische Autoimmunkrankheiten sind Thyreotoxikose, Schilddrüsen-bedingtes Myxödem, HASHIMOTO Thyreoiditis, generalisierte Endokrinopathie, perniziöse Anämie, chronische Gastritis Typ A, Krankheiten einzelner oder aller korpuskulären Elemente des Blutes (zum Beiapiel autoimmunhämolytische Anämie, idiopath. Thrombozytopenie bzw. -pathie ; idiopath. Leukopenie bzw. Agranulozytose), Pemphigus vulgaris und Pemphigoid, sympathische Ophthalmie und manche Uveitis-Formen, primär biliäre Leberzirrhose und chronisch aggressive Autoimmunhepatitis, Diabetes mellitus Typ I, CROHN Krankheit und Colitis ulcerosa, SJÖGREN Syn- drom, ADDISON Krankheit, Lupus erythematodes disseminatus und als diskoide Form dieser Krankheit, als Dermatomyositis und Sklerodermie, rheumatoide Arthritis (= primär-chro- nische Polyarthritis), Antiglomerulusbasalmembran-Nephri- tis. Grundlage sind eine aggressive Immunreaktion infolge Zusammenbruchs der Immuntoleranz gegenüber Selbst-Dertermi- nanten und eine Abnahme der Aktivität der T-Suppressor zellen (mit Lymphozytenmarker T 8) bzw. ein Übergewicht der T-Helferzellen (mit Lymphozytenmarker T 4) über die Sup- pressorzellen ; ferner ist die Bildung von Autoantigenen möglich, zum Beispiel durch Verbindung von Wirtsproteinen mit Haptenen (zum Beispiel Arzneimittel), durch onto- genetisches Gewebe, das sich erst nach Entwicklung der Selbsttoleranz entwickelt und für durch Änderungen der Konformation der Proteine demaskierte Proteinkomponenten im Zusammenhang zum Beispiel mit Infektion durch Viren oder Bakterien ; ferner für im Zusammenhang mit Neoplasien ent- standene neue Proteine. (iii) Arthritis im Sinne der Erfindung sind Gelenk- entzündungen als Oberbegriff für primäre bzw. sekundäre entzündliche Gelenkerkrankungen. Bevorzugte Arthritis- erkrankungen sind die juvenile chronische, die A. mutilans, die paraneoplastische, die A. psoriatica, die reaktive und/oder die rheumatoide Arthritis. Auch zur Unterdrückung der Abstoßung von Transplantaten oder bei der Behandlung des Typ-I-Diabetes können liposo- male Formulierungen von Glucocorticoiden mit Vorteil ver- wendet werden. Eine ganz besonders bevorzugte Indikation ist die rheuma- thische Arthritis. So wird bei gleicher Wirkstoffmenge ein erheblich besserer therapeutischer Effekt beobachtet. Eine antigeninduzierte Arthritis in Ratten konnte mit 0,375 mg liposomalem Dexa- methasonphosphat pro kg Körpergewicht nahezu vollständig unterdrückt werden. Tiere, die eine identische Dosis des unverpackten Wirkstoffs erhielten, entwickelten nach kurzer Besserung alle Symptome des Tiermodells. Im Folgenden soll die Ausführung der erfinderischen Lehre an einigen Beispielen verdeutlicht werden, ohne dass sie auf diese Beispiele beschränkt ist. Beispiel 1 Herstellung Dexamethason-Phosphat gefüllter Liposomen Ein Gemisch aus 50 mol% DPPC, 10 mol% DPPG und 40 mol% Chol wird in Chloroform gelöst und anschließend im Rotations- verdampfer im Vakuum vollständig getrocknet. Der Lipidfilm wird mit so viel Dexamethason-Phosphat-Lösung (25 mg/ml Dexamethason-Phosphat in 10 mM Hepes, 150 mM NaCl pH 7.5) versetzt, dass eine 100 mM Suspension entsteht. An- schließend wird diese Suspension für 45 Minuten im Wasser- bad bei 50 °C unter Rotieren hydratisiert und für weitere 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Danach wird die Lösung eingefroren. Nach dem Auftauen werden die Liposomen mehrfach durch eine Membran mit einer Porenweite von 400 nm extrudiert. Die Ab- trennung des nicht eingeschlossenen Dexamethason-Phosphats erfolgt über Gelfiltration. Beispiel 2 Bestimmung der Freisetzung von Dexamethason-Phosphat Liposomen wurden wie in Beispiel 1 hergestellt und mit Puf- fer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl pH 7.5) auf eine Konzentration von 12 mM Lipid verdünnt. Anschließend werden sie bei 37 °C inkubiert. Aliquots dieser Inkubationslösung werden zu de- finierten Zeitpunkten (vergleiche nachfolgende Tabelle) entnommen. Die entnommenen Aliquots werden mittels RP-HPLC auf ihren Gehalt an Dexamethason-Phosphat vermessen. Formu-Lipidmol % 024120 lierung Stunden Stunden Stunden A DPPC/DPPG/Chol 50 : 10 : 40 1, 1 6, 0 7, 3 Tabelle 1 Freisetzung von Dexamethason-Phosphat zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Inkubation bei 37 °C in Puffer in % der eingeschlossenen Menge Die Liposomen zeigen über den untersuchten Messzeitraum eine hinreichende Stabilität. Über einen Zeitraum von 5 Ta- gen werden weniger als 8 % des eingeschlossenen Wirkstoffs freigesetzt. Beispiel 3 Einsatz von liposomalem Dexamethason-Phosphat In den Versuchstieren (Ratten) wurde entsprechend Buchner ("Behandlung der antigeninduzierten Arthritis der Ratte mit Anti-Makrophagenprinzipien und monoklonalen Anti-CD4 Anti- körpern", Dissertation 1996 an der Friedrich-Alexander-Uni- versität Erlangen-Nürnberg, S. 129) eine antigeninduzierte Arthritis ausgelöst. Die Arthritis wurde am Tag 0 entsprechend Buchner durch intraartikuläre Injektion des Antigens in den Synovialspalt im rechten Knie ausgelöst. Die arthritischen Tiere wurden 6,24 und 48 Stunden nach Induktion der Arthritis intra- venös mit liposomalem Dexamethason-Phosphat (Formulierung A 3,75 mg/kg) behandelt. Als Kontrolle dienen freies Dexa- methason-Phosphat (Formulierung K, ebenfalls 3,75 mg/kg) und physiologische Salzlösung (Saline). Die Wirkung der Probengabe wurde anhand folgender Parameter ermittelt : - Bestimmung der Gelenkschwellung (vgl. Figur 1) - histologische Begutachtung von Entzündungsparametern und Parametern der Gelenkknorpelzerstörung (vgl. Figur 2 und Tabelle 2) Formulierung Grad der Grad der Knorpelzerstörung Gelenkentzündung Saline 4, 0 5, 5 Formulierung K 2, 75 3,5 Formulierung A 0, 25 0,25 Tabelle 2 Grad der Gelenkknorpelzerstörung und Gelenkentzündung der arthritischen Tiere nach Behandlung 0-keine Veränderungen im Vergleich zum gesunden Knie 6 - starke Veränderungen im Vergleich zum gesunden Knie Sowohl Gelenkknorpelzerstörung als auch Entzöndungsreak- tionen werden durch Behandlung mit liposomalem Dexametha- son-Phosphat wirksam verringert. Freier Wirkstoff in der angegebenen Konzentration ist erheblich schlechter wirksam. Beispiel 4 Einsatz von liposomalem Dexamethason-Phosphat zur Dosis- reduktion Eine Arthrits wurde analog Beispiel 3 an Ratten ausgelöst und diese mit folgenden Formulierungen behandelt, die nur ein Zehntel der in Beispiel 3 angegebenen Dosis Dexa- methason-Phosphat enthielten : Formulierung A 25 gg = 0,375 mg/kG KG Formulierung K 25 gg = 0,375 mg/kG KG Die gemessenen Gelenkschwellungen werden auch in der Figur 1 dargestellt. Ein fast gleicher therapeutischer Effekt ist auch mit der verringerten Dosis festzustellen, die Gelenk- schwellung bildet sich bei Formulierung A nach etwa 3 Tagen vollständig zurück, was bei Formulierung K nicht auftritt. Beispiel 5 Visualiserung der Liposomenverteilung im Körper Als Label wurde der Fluoreszenzfarbstoff Cy5. 5'm (Amersham Bioscience) eingesetzt, der ein Anregungsmaximum bei 675 nm und ein Fluoreszenzmaximum bei 694 nm, das heißt im. nahen Infrarot hat und durch Bestrahlung durch die Haut angeregt werden kann. Cy5. 5""-BSA wurde durch Kopplung des Cy5. 5'm- NHS-Esters an BSA nach dem Protokoll von Amersham-Bio- science erhalten. Mit Cy5. 5-BSA gefüllte Liposomen wurden in der Zusammen- setzung DPPC/DPPG/Chol 50 : 10 : 40 analog Beispiel 1 herge- stellt. - nicht eingeschlossenes Cy5. 5 wurde durch Waschen (Hepes 10mM, mit 150 mM NaCl) und Sedimentation (65000 rpm mit Beckman Rotor 100.4, 40 min, bei 21°C) abgetrennt und die Liposomen mit physiologischer Kochsalzlösung auf 6,5 mM im Lipid verdünnt (Gehalt an Cy5. 5 TM : 8 nmol/mL). -Versuchstiere : Mäuse mit etablierter AIA (antigen-indu- zierter Arthritis), analog wie im vorherigen Beispiel beschrieben. Am 7. Tag nach Auslösung der Arthritis wurde den Tieren intravenös in die Schwanzvene einmal 100 yL liposomal verkapseltes Cy5. 5 appliziert. die Fluoreszenzmessung erfolgte nach 6 Stunden mit NIR- Fotografie (Nah-Infarot), dabei wurden arthritisches und gesundes Kniegelenk getrennt vermessen. Figur 3 zeigt als helle Stellen, Orte, an denen eine An- reicherung des Farbstoffes Cy5. 5 stattgefunden hat. Die Signalstärken sind in etwa wie folgt : 900 im arthritischen Gelenk ; 600 im gesunden Gelenk ; 2500 in Leber und Milz. Durch Messung der Zunahme des Fluoreszenzsignals konnte die Aufnahme der Liposomen in die Gelenke in einer Zeitreihe verfolgt werden. Dies wird in Figur 4 gezeigt. Man erkennt, dass im arthri- tischen Gelenk für den Zeitraum der ersten 12 bis 24 Stunden eine stärkere Anreicherung des Cy5. 5 erfolgt als im gesunden Gelenk. Beispiel 6 Herstellung Dexamethason-Phosphat gefüllter amphoterer Liposomen Ein Gemisch aus 60 mol% POPC, 20 mol% MoChol und 20 mol% Chems wird in Chloroform gelöst und anschließend im Ro- tationsverdampfer im Vakuum vollständig getrocknet. Der Lipidfilm wird mit so viel Dexamethason-Phosphat-Lösung (25 mg/ml Dexamethason-Phosphat in 10 mM Hepes, 150 mM NaCl pH 7.5) versetzt, dass eine 100 mM Suspension entsteht. An- schließend wird diese Suspension für 45 Minuten im Wasser- bad bei 50 °C unter Rotieren hydratisiert und für weitere 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Danach wird die Lösung eingefroren. Nach dem Auftauen werden die Liposomen mehrfach durch eine Membran mit einer Porenweite von 400 nm extrudiert. Die Abtrennung des nicht eingeschlossenen Dexamethason-Phospha- tes erfolgt über Gelfiltration. Es werden analog folgende mit Dexamethason-Phosphat gefüll- ten Liposomen hergestellt : Lipid mol% POPC/MoChol/Chems 60 : 20 : 20 POPC/HisChol/Chems 60 : 20 : 20 POPC/DOTAP/Chems 60 : 10 : 30 POPC/HistChol/Chol 60 : 20 : 20 DPPC/AC/Chol 50 : 10 : 40 Tabelle 3 Beispiele möglicher Liposomenformulierungen für den Ein- schluss von wasserlöslichen Glucocorticoiden. Beispiel 7 Bestimmung der Freisetzung von Dexamethason-Phosphat aus amphoteren Liposomen Liposomen wurden wie in Beispiel 6 hergestellt und mit Puf- fer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl pH 7.5) auf eine Konzentration von 12 mM Lipid verdünnt. Anschließend werden sie bei 37 °C inkubiert. Aliquots dieser Inkubationslösung werden zu de- finierten Zeitpunkten (vgl. nachfolgende Tabelle) ent- nommen. Die entnommenen Aliquots werden mittels RP-HPLC auf ihren Gehalt an Dexamethason-Phosphat vermessen. Formu-Llpid mol 0 24 120 lierung Stun-Stunden Stun- den den POPC/MoChol/Chems 60 : 20 : 20 4, 6 10, 5 10, 0 B POPC/HisChol/Chems 60 : 20 : 20 6,7 14,1 10,8 C POPC/DOTAP/Chems 60 : 10 : 30 4,4 4, 2- POPC/HistChol/Chol 60 : 20 : 20 8,7 7, 0- DPPC/AC/Chol 50 : 10 : 40 1,7 7,8 7,4 Tabelle 4 Freisetzung von Dexamethason-Phosphat zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Inkubation bei 37 °C in Puffer in % der eingeschlossenen Menge Die unterschiedlichen Liposomen zeigen über den untersuch- ten Messzeitraum eine hinreichende Stabilität. Über einen Zeitraum von 5 Tagen werden weniger als 6 %, oft weniger als 4 % des eingeschlossenen Wirkstoffs freigesetzt. Beispiel 8 Einsatz von Dexamethason-Phosphat formuliert in amphoteren Liposomen In den Versuchstieren wurde analog Beispiel 3 eine anti- geninduzierte Arthritis ausgelöst. Die Arthritis wurde am Tag 0 durch intraartikuläre Injektion des Antigens in den Synovialspalt im rechten Knie ausgelöst. Die arthritischen Tiere wurden 6,24 und 48 Stunden nach Induktion der Arthritis intravenös mit liposomalem Dexamethason-Phosphat (Formulierung B, C, je 3,75 mg/kg, nach Tabelle 4) be- handelt. Als Kontrolle dienen freies Dexamethason-Phosphat (Formulierung K, ebenfalls 3,75 mg/kg) und physiologische Salzlösung (Saline). Die Wirkung der Probengabe wurde an- hand folgender Parameter ermittelt : - Bestimmung der Gelenkschwellung (vgl. Figur 5) - histologische Begutachtung von Entzündungsparametern und Parametern der Gelenkknorpelzerstörung (vgl Figur 2 und Tabelle 5) Formulierung Grad der Grad der Knorpelzerstörung Gelenkentzündung Saline 4, 0 5, 5 Formulierung K 2, 75 3,5 Formulierung B 0 0,25 Formulierung C 1, 0 1,5 Tabelle 5 Grad der Gelenkknorpelzerstörung und Gelenkentzündung der arthritischen Tiere nach Behandlung 0-keine Veränderungen im Vergleich zum gesunden Knie 6-starke Veränderungen im Vergleich zum gesunden Knie Sowohl Gelenkknorpelzerstörung als auch Entzündungsreak- tionen werden durch Behandlung mit liposomalem Dexa- methason-Phosphat wirksam verringert. Freier Wirkstoff in der angegebenen Konzentration ist erheblich schlechter wirksam. Beispiel 9 Dosisreduktion Eine Arthrits wurde analog Beispiel 8 an Ratten ausgelöst und diese mit folgenden Formulierungen behandelt, die nur ein Zehntel der in Beispiel 8 angegebenen Dosis Dexa- methason-Phosphat enthielten : Formulierung Bq25 yg = 0,375 mg/kG KG Formulierung K 25 yg = 0,375 mg/kG KG Die gemessenen Gelenkschwellungen werden auch in der Figur 5 dargestellt. Ein fast gleicher therapeutischer Effekt ist auch mit der verringerten Dosis festzustellen, die Gelenk- schwellung bildet sich bei Formulierung B nach etwa 3 Tagen vollständig zurück, was bei Formulierung K nicht auftritt. Figurenbeschreibung Figur 1 Gelenkschwellung der arthritischen Tiere über den Untersuchungszeitraum von 21 Tagen nach Auslösung der Arthritis im rechten Knie im Vergleich zum gesunden linken Knie Figur 2 Histologische Schnitte der arthritischen Kniegelenke. Hämatoxylin/Eosin-Färbung, 92fache Vergrößerung K-Formulierung K, starke Entzündung und Knorpel-und Knochendestruktion A-Formulierung A, geringfügig entzündliche Infiltration C-Formulierung C, keine Entzündungsreaktion Figur 3 Infrarotfluoreszenz einer Ratte, die mit Cy5. 5'"-BSA gefüll- ten Liposomen der Formulierung DPPC/DPPG/Chol 50 : 10 : 40 be- handelt wurde. Figur 4 Vergleich der zeitlichen Anreicherung der Liposomen im arthrithischen zum nicht arthrithischen Gelenk. Figur 5 Gelenkschwellung der arthritischen Tiere über den Untersuchungszeitraum von 21 Tagen nach Auslösung der Arthritis im rechten Knie im Vergleich zum gesunden linken Knie : Formulierung 3 HisChol = Formulierung B Formulierung 5 DOTAP = Formulierung C Formulierung DXM-Phosphat = Formulierung K Abkürzungen : HistChol Na-Histidinyl-Cholesterolhemisuccinat DOTAP N- [1- (2, 3-Dioleoyloxy) propyl]-N, N, N- trimethylammonium MoChol 4- (2-Aminoethyl)-Morpholino- Cholesterolhemisuccinat HisChol Histaminyl-Cholesterolhemisuccinat AC Palmitoylcarnosin (Acylcarnosin) Chems Cholesterylhemisuccinat DPPC Dipalmitoylphosphatidylcholin DPPG Dipalmitoylphosphatidylglycerol POPC Palmitoyloleoylphosphatidylcholin Chol Cholesterol BSA Rinderserumalbumin Literatur Mizushima, Y. ; Hamano, T. ; Yokoyama, K. (1982) : Tissue distribution and anti-inflammatory activity of corti- costeroids incorporated in lipid emulsion. 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WO 02/45688 (Yamanouchi Euro BV) : Parenteral compositions for site-specific treatment of inflammatory disorders comprises liposomes composed of non-charged vesicle-forming lipids and a water soluble corticosteroid WO 95/15746 (Univ. London School Pharmacy) : New liposomes, esp. For drug delivery-having an internal aq. Phase cont. Complex of active cpd. With receptor, e. g. for rendering hydrophobic drugs hydrophilic WO 94/07466 (Liposome Technology Inc. ) : Treatment of inflamed tissue-using liposomes contg. a lipid derivati- sed with polyethylene glycol entrapping a therapeutic cpd. DE 27 12 030 (Imperial Chem Ind., 1977) : Antiinflammatory medicaments based on liposomes-contg. a lipophilically subst. steroid We claim 1. A liposomal formulation of water-soluble glucocorticoids and phospholipids wherein water soluble glucocorticoids are present in the interior aqueous phase of the lipo-some and which in the plasma or tissue is in a concentration in the range of 0.1 to 10.000µM and the liposome have a size between 150 and 500 nm; phospholipids has a content of negative charge carrier of no higher than 20 mole-% and a cholesterol content between 35 and 50 mole % or the formulation is an amphoteric liposome and free from any amphiphilic-modified polyethylene glycol. 2. The liposomal formulation as claimed in claim 1, wherein the cholesterol content is between 35 and 45 mole-%. 3. The liposomal formulation as claimed in claim 1 or 2, wherein the content of nega tive charge carriers is between 5 and 15 mole-%. 4. The liposomal formulation as claimed in claim 1, wherein amphoteric liposomes in their membrane comprises neutral, cationic and anionic lipids, and the molar proportion of anionic lipids is no higher than 40 mole-%, that of cationic lipids is no higher than 40 mole- %, and that of neutral lipids is 30 to 80 mole-%. 5. The liposomal formulation as claimed in claim 1, wherein the liposome membrane of said amphoteric liposomes contains neutral and amphoteric lipids and that the molar pro portion of the amphoteric lipids is not higher than 40 mole-% and that of the neutral lipids 30 to 80 mole-%. 6. The liposomal formulation as claimed in claim 1, wherein the phospholipids are selected from the group comprising dipalmitoylphosphatidyl choline, distearoylphosphatidyl choline, dipalmitoyl phosphatidyl glycerol, distearoylphosphatidyl glycerol, dipalmitoyl phosphatidyl serine, and distearoylphosphatidyl serine. 7. The liposomal formulation as claimed in claim any of claim 4 or 5, wherein the neutral lipids are selected from the group comprising dimyristoylphosphatidyl choline , dipalmitoylphosphatidyl choline, palmitoyloleoylphosphatidyl choline ,distearoyl-phosphatidyl choline and/or cholesterol, or comprise purified choline fractions of natural origin such as soy phosphatidyl choline or egg phosphatidyl choline. 8. The liposomal formulation as claimed in claim 1,2 or 3, wherein the phospholipids having negative charge are any of phosphatidyl glycerol and phosphatidyl serine, preferably phosphatidyl glycerol or dipalmitoyl phosphatidyl glycerol. 9. The liposomal formulation as claimed in claim 1, wherein the water-soluble gluco- corticoids are phosphate esters, glycosides or sulfate esters. 10. The liposomal formulation as claimed in claims 1 to 9,wherein the water-soluble glucocorticoid is selected from the group comprising dexamethasone phosphate, dexa- methasone dihydrogen phosphate disodium, triamcinolone acetonide phosphate, prednisolone phosphate. 11. The liposomal formulation as claimed in claims 1 to 10 prepared as intramuscular injection, subcutaneous injection, intravenous injection, nebulizer, suppositorie, suspension, solution, gel, emulsion, brew-up formulation, drop, concentrate, syrup, bolus, aerosol, spray and or inhalant. 12. The liposomal formulation as claimed in any of claims 1 to 11 is used for the treat ment of inflammatory diseases, including rheumatoid arthritis.

Full Text

Liposomale Glucocorticoide Beschreibung Die Erfindung betrifft eine liposomale Formulierung umfas- send wasserlösliche Glucocorticoide, die Verwendung dieser Formulierung zur Behandlung von inflammatorischen Erkran- kungen sowie einen Kit, der die liposomale Formulierung, zum Beispiel als ein pharmazeutisches Mittel, umfasst.
Glucocorticoide sind eine Klasse von Substanzen, die seit langem zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen einge- setzt werden. Die Einarbeitung von Wirkstoffen aus dieser Klasse in liposomale Formulierungen ist konzeptionell be- kannt und mehrfach beschrieben. Dabei ist die Formulierung der unmodifizierten Arzneiform schwierig, da liposomal ein- geschlossenes Material innerhalb von wenigen Stunden wieder freigesetzt wird. Die bekannten Strategien werden im Fol- genden kurz mit Beispielen referiert : Lipophile Derivatisierung zum Einbau in die Liposomenmem- bran : Die DE 27 120 30 (ICI 1977) ist ein frühes Beispiel, dass lipophil substituierte Glucocorticoide, beispielsweise Dexamethasonpalmitat, sich stabil in Liposomen einschließen lassen (auch : Mizushima et al. 1982, Yokoyama et al. 1985, Bonanomi et al. 1987). Nachteilhaft an diesen Formulie- rungen ist der Austausch des hydrophoben Wirkstoffderivats mit Plasmabestandteilen und eine geringe in vivo-Stabilität der Formulierungen.
PEG-Liposomen : Eine Verbesserung demgegenüber wird in der WO 94/07466 (Liposome Technology) offenbart. Durch die Ver- wendung von PEG (Polyethylenglykol) -modifizierten Lipiden lässt sich die in vivo-Stabilität der Formulierung erhöhen und insbesondere die Zirkulationszeit der Liposomen ver- längern. Konzeptionell zielt diese Verbesserung darauf, den unspezifischen Verlust von eingebrachten Liposomen im reti- kuloendothelialen System zu vermindern und dadurch die spe- zifische Extravasierung von Liposomen an den Entzündungs- herden zu ermöglichen oder zu verbessern.
Wasserlösliche Glucocorticoide können passiv in Liposomen eingeschlossen werden. Derivate wie Phosphatester, Aceto- nidphosphate und/oder Succinate sind dazu geeignet. Neuere Entwicklungen wie die EP 1 046 394 (Terumo Corp) und die WO 02/45688 (Gerrit Storm) gehen diesen Weg, wobei die was- serlöslichen Glucocorticoide in PEG-modifizierten Liposomen eingschlossen werden (siehe auch : Storm & Richmond 2001, Metselaar et al. 2002, Hussein et al. 2002).
Cyclodextrin-Komplexe mit Glucocorticoiden sind eine andere Möglichkeit, ein wasserlösliches Derivat zu schaffen, wel- ches auf üblichem Weg in Liposomen eingebracht werden kann (Loftsson & Stefansson, 2002, Yano et al. 2002, WO 95/15746 (Gregoriadis)).
Weiterhin sind in der WO 99/15150, der WO 99/55314 und EP 1 190 707 Liposomen offenbart, die wasserlösliche Gluco- corticoide enthalten.
Der Stand der Technik hat den Nachteil, dass die erzielten Verbesserungen im Zirkulationsverhalten im Wesentlichen nur bei der erstmaligen Gabe der Formulierung erreicht werden können. Bei mehrmaliger Gabe von PEG-modifizierten Lipo- somen wird die Bildung von Antikörpern nachgewiesen. Deren Bindung führt bei wiederholter Anwendung zu einer Verringe- rung der Zirkulationshalbwertszeit und ist pharmakologisch unerwünscht (Dams et al. 2000).
Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, liposomale Formu- lierungen von Glucocorticoiden bereitzustellen, die die ge- nannten Nachteile vermeiden und eine vorteilhafte Wirkung gegenüber dem freien Wirkstoff aufweisen.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch die Bereit- stellung einer liposomalen Formulierung, die in einer in- neren wässrigen Phase wasserlösliche Glucocorticoide auf- weist und kein amphiphil modifiziertes Polyethylenglykol umfasst sowie in tierischem oder menschlichem Blutserum über Stunden stabil ist.
Über Stunden stabil heißt im Sinne der Erfindung, dass die Formulierung mindestens eine, bevorzugt zwei, besonders bevorzugt drei bis vier Stunden und ganz besonders bevorzugt über fünf bis 24 Stunden stabil im Serum ist.
Überraschenderweise sind die erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen über einen langen Zeitraum im Serum von Organismen anders als die bekannten Strukturen stabil. Das Merkmal der Stabilität ist daher anmeldungsgemäß nicht als Aufgabe an den Fachmann zu verstehen, sondern es dient allein der Klarstellung dahingehend, dass die beschriebenen erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen dieses Merkmal aufweisen. Die erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen bzw. Liposomen sind im Wesentlichen frei von konjugierten Polymeren, insbesondere frei von PEG, PEG- Phosphatidylethanolamin, PEG-Phosphatidylglycerol, PEG-Phosphatidylserin und/oder PEG-Cholesterol bzw. anderen amphiphil modifizierten Polyethylenglykolen.
Überraschend wurde festgestellt, dass liposomale Zubereitungen von Glucocorticoiden, die ohne den Zusatz von PEG-Lipiden hergestellt werden, bei systemischer Anwendung hinreichend stabil sind und eine sehr vorteilhafte Wirkung gegenüber dem freien Glucocorticoid aufweisen, so dass ein besserer therapeutischer Effekt mit einer geringeren Dosis erzielt werden kann. Die erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen, liposomalen Zubereitungen bzw. Liposomen können demgemäß in verschiedenen Bereichen der Diagnose, Prophylaxe und Therapie eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Strukturen können bevorzugt zur Therapie von entzündlichen Krankheiten eingesetzt werden. Eine bevorzugte Auswahl der Indikationen von Glucocorticoiden ist : - schwere allergische und anaphylaktische Reaktionen, - anaphylaktischer Schock, Status asthmaticus, schwere Zustände bei Asthma bron- chiale, Hirnödem, Schädel-Hirn-Trauma, Hirnabszess, bakterielle Meningitis, Parenterale Anfangsbehandlung akuter schwerer Haut- erkrankungen, (Erythrodermie, Pemphigus vulgaris, akute Ekzeme), schwere Infektionserkrankungen, Nebennierenrinden- Insuffizienz, idiopathische retroperitoneale Fibrose, Morbus Addison, Adrenogenitales Syndrom, chronisch aggressive Hepatitis, Lymphogranulomatose, Differentialdiagnose von Morbus Cushing, primäre chronische Polyarthritis (rheumatoide Arthri- tis), chronische Polyarthritis, juvenile Arthritiden (Still-Syndrom), akute rheumatische Karditis, Arthrosen, aktivierte Arthrose, akute Form der Periarthropathia humeroscapularis, nichtbakterielle Tendovaginitis und Bursitis, Periarthropathien, Insertionsendopathien, Psoriasis- Arthritis, Spondylitis ankylosans (Morbus Bechterew), Spondylarthrosen mit Synovitis (aktivierte Arthrose), Spondylosen, Riesenzellarteriitis, Morbus Wegener, Churg-Strauß- Syndrom, mikrosk. Polyangiitis, nichtinfektiöse Keratokonjunktivitis, Skleritis, Iridozyklitis, Uveitis, Kollagenosen (system. Lupus erythematods (vor allem Nephritis), Panarteriitis nodosa, Dermatomyositis, primäres Sjögren-Syndrom), -akute Schübe von Morbus Crohn, schwere Schübe von Colitis ulcerosa (zum Beispiel toxisches Colon), - Multibles Myelom, - PFAFA-Syndrom (periodisches Fieber bei Kindern), - idiopathische retroperitoneale Fibrose (Morbus Ormond), -Multiple Sklerose, akute Myasthenia gravis-Krise, angio- neurotische Ödeme (zum Beispiel Quincke-Syndrom) und/oder - akute Alveolitis.
Selbstverständlich ist es möglich, verschiedene wasserlös- liche Glucocorticoide einzusetzen. Der Einsatz der verwen- deten Glucocorticoide richtet sich insbesondere nach den unterschiedlichen Applikationsrouten. Systemisch applizier- te Glucocorticoide sind bevorzugt : Betamethason, Beta- methasondihydrogenphosphat-Dinatrium, Budesonid, Clopred- nol, Cortison, Cortisonacetat, Deflazacort, Dexamethason, Dexamethasondihydrogenphosphat-Dinatrium, Fluocortolon, Hydrocortison, Methylprednisolon, Prednisolon, Prednison, Prednyliden, Rimexolon und/oder Triamcinolon.
Dermal werden bevorzugt appliziert : Alclometason, Amcino- nid, Betamethason, Clobetasol, Clobetason, Clocortolon, Desonid, Desoximethason, Dexamethason, Diflorason, Diflucortolon, Fludroxycortid, Flumethason, Flucinolon, Flucinonid, Fluocortin, Fluocortolon, Fluorometholon, Flupredniden, Fluticason, Halcinonid, Halomethason, Hydo- cortison, Methylprednisolon, Mometason, Prednicarbat, Prednisolon und/oder Triamcinolon.
Bevorzugt werden im Zusammenhang mit der Erfindung die systemisch applizierten Glucocorticoide, ausgewählt aus obiger Liste, in einer wasserlöslichen Form eingesetzt. Dem Fachmann bekannte wasserlösliche Formen sind Salze und Ester der genannten Wirkstoffe, wie insbesondere die Phosphatester, Sulfatester oder die Dicarbonsäureester oder Additionssalze oder die Glycoside der Wirkstoffe.
Es werden bevorzugt die Mono-oder Disalze eingesetzt, ganz besonders bevorzugt die Natrium-oder Kaliumsalze der Glucocorticoidphosphate, die-acetonidphosphate oder - succinate.
Besonders bevorzugte Verbindungen aus dieser Gruppe sind Betamethasondihydrogenphosphat-Dinatrium, Dexamethason- phosphat, Dexamethasondihydrogenphosphat-Dinatrium, Predni- solonphosphat, Methylprednisolonphosphat, Prednisolon- succinat, Methylprednisolonsuccinat, Bemethasonphosphat, Desonidphosphat, Hydrocortisonphosphat, Hydrocortison- succinat, Prednisolatmahydrochlorid, Prednisonphosphat und/oder Triamcinoloneacetonidphosphat.
Ganz besonders bevorzugte Verbindungen aus dieser Gruppe sind Dexamethasonphosphat, Dexamethasondihydrogenphosphat- Dinatrium und/oder Triamcinoloneacetonidphosphat.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen Verbindungen können be- sonders gut gegen inflammatorische Erkrankungen eingesetzt werden. Der Einsatz der erfindungsgemäßen liposomalen For- mulierungen führt zu Vorteilen und Verbesserungen gegenüber den bekannten liposomalen Formulierungen, insbesondere zu einer erhöhten Zuverlässigkeit und Qualitätshebung und größeren Effektivität in der Prophylaxe und Therapie der genannten Erkrankungen. Demgemäß wird durch die erfindungs- gemäßen Liposomen der Arzneimittelschatz bereichert und es werden die prophylaktischen und therapeutischen Möglich- keiten der Behandlung verschiedener Erkrankungen vermehrt.
Da die erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen eine bessere Wirkung gegenüber dem freien Wirkstoff zeigen, kann dieser in einer niedrigeren Dosis angewendet werden, was zu einem verringerten Nebenwirkungsspektrum führt, ein nicht zu überschätzender Vorteil bei der Therapie mit Glucocorticoiden. Außerdem führt eine Dosisverringerung zu einer Ersparnis an Material, Kosten und schwer zu beschaf- fenden Feinchemikalien und pharmazeutischen Mitteln. Mit den erfindungsgemäßen Strukturen wird somit ein seit langem ungelöstes dringendes Bedürfnis befriedigt.
Dem Fachmann sind Liposomen bekannt, die er einsetzen muss, um eine möglichst große Serumstabilität zu erreichen und die Bildung von Aggregaten zu verhindern. Besonders be- vorzugt werden Liposomen mit einer Größe zwischen 150 nm und 500 nm verwendet.
Liposomen dieser Art sind dem Fachmann bekannt und umfassen auch Liposomen, die aus gesättigten Phospholipiden und Cholesterol aufgebaut sind. In einer bevorzugten Ausführung der erfinderischen Lehre werden zum Aufbau der Liposomen die folgenden Lipide eingesetzt : Dipalmitoylphosphytidyl- cholin, Distearoylphosphytidylcholin, Dipalmitoylphosphati- dylglycerol, Distearoylphosphatidylglycerol, Dipalmitoyl- phosphatidylserin, Distearoylphosphatidylserin, Choleste- rol.
Unter den Mischungen dieser Substanzen sind solche bevor- zugt, die einen Anteil negativer Ladungsträger von nicht mehr als 20 mol% aufweisen. Weiter bevorzugt sind solche Mischungen, bei denen der Anteil negativer Ladungsträger zwischen 5 und 15 mol% liegt. Phosphatidylglycerole und Phosphatidylserine sind negative Ladungsträger in solchen Membranen.
Die erfindungsgemäß bevorzugten Mischungen von Lipiden um- fassen bevorzugt solche, die entweder kein Cholesterol oder zwischen 35 und 50 mol% Cholesterol enthalten. Ganz beson- ders bevorzugt sind Liposomen, die zwischen 35 und 45 mol% Cholesterol enthalten.
PH-sensitive Liposomen sind ebenfalls bekannt und umfassen insbesondere Cholesterolhemisuccinat (CHEMS), da dessen Carboxylgruppe durch unterhalb von pH 5 mehr und mehr entladen wird. Mit Vorteil wird dieses Lipid in Verbindung mit Phosphatidylethanolamin verwendet. Solche Liposomen mit einem Gehalt von 35 bis 50 mol% CHEMS und 65 bis 50 mol% Phosphatidylethanolamin sind bei neutralem pH-Wert stabil und zerfallen bei einem pH-Wert unterhalb von 5, wie er etwa bei der endosomalen Aufnahme erreicht wird. Anstelle des CHEMS kann auch ein anderes pH-sensitives Lipid eingesetzt werden, beispielweise Phosphatidylserin.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführung der Erfin- dung werden amphotere Liposomen verwendet. Ein besonderes Merkmal dieser Liposomen ist, dass deren Oberflächenladung sich mit dem pH-Wert der Umgebung ändert, von kationisch im sauren zu anionisch im basischen pH-Bereich.
Die WO 02/066012 beschreibt pH-sensitive amphotere Lipo- somen, deren amphoteres Verhalten durch die gleichzeitige Anwesenheit von kationischen und anionischen Ladungsträgern in der Membran bestimmt ist und sich durch geeignete Aus- wahl und Verhältnisse der Komponenten variieren lässt.
Als negativer Ladungsträger von amphoteren Liposomen nach WO 02/066012 werden bevorzugt natürliche Lipide eingesetzt, insbesondere : Dipalmitoylphosphatidylglycerol, Distearoyl- phosphatidylglycerol, Dipalmitoylphosphatidylserin, Di- stearoylphosphatidylserin, aber auch synthetisch herge- stellte Lipide, wie beispielsweise Cholesterolhemisuccinat oder CHEMS, Diacylglycerolhemisuccinate.
Als kationischer Ladungsträger von amphoteren Liposomen nach WO 02/066012 können Lipide verwendet werden, bevor- zugt : DC-Chol 3-ß-[N-(N, N-dimethylethane) carbamoyl] choleste- rol, TC-Chol 3-ß-[N-(N, N, N-trimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol, BGSC Bis-guanidinium-spermidine-cholesterol, BGTC Bis-guanidinium-tren-cholesterol, DOTAP (1, 2-dioleoyloxypropyl) -N, N, N-trimethylammonium- chlorid, DOSPER (1, 3-dioleoyloxy-2- (6-Carboxy-spermyl)-propylamid), DOTMA (1, 2-dioleyloxypropyl) -N, N, N-trimethylammonium- chlorid) (Lipofectin&commat;), DORIE (1, 2-dioleyloxypropyl) -3 dimethylhydroxyethyl ammoniumbromid), DOSC (1, 2-dioleoyl-3-succinyl-sn-glycerl cholinester), DOGSDSO (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-succinyl-2hydroxyethyl disulfide ornithin), DDAB Dimethyldioctadecylammonium bromid, DOGS ((C18) 2GlySper3+) N, N-dioctadecylamido-glycyl-spermin (Transfectam&commat;), (C18) 2Gly+ N, N-dioctadecylamido-glycin, CTAB Cetyl-trimethylammoniumbromid, CPyC Cetyl-pyridiniumchlorid, DOEPC 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin oder andere O-Alkyl-Phosphatidylcholin oder-ethanolamine und/oder Amide aus Lysin, Arginin oder Ornithin und Phosphatidyl- ethanolamin.
Auch pH-sensitiv positive Ladungsträger können Bestandteile von amphoteren Liposomen nach WO 02/066012 sein. Es werden bevorzugt Lipide verwendet, wie sie beispielsweise in der WO 02/066490 und WO 03/070220 offenbart sind, beispiels- weise 4- (2-Aminoethyl)-Morpholino-Cholesterolhemisuccinat und/oder Histaminyl-Cholesterolhemisuccinat.
In einer bevorzugten Ausführung der erfinderischen Lehre wird zum Aufbau der amphoteren Liposomen eine Lipidmatrix mit neutralen Gerüstlipiden aufgebaut, die folgende Lipide miteinschließt : Dimyrystoylphosphytidylcholin, Dipalmitoylphosphytidyl- cholin, Palmitoyloleoylphosphatidylcholin, Distearoyl- phosphytidylcholin, Cholesterol, sowie gereinigte Cholin- fraktionen natürlichen Ursprungs wie Soja-Phosphatidyl- cholin oder, Ei-Phosphatidylcholin.
Die WO 02/066489 beschreibt amphotere Liposomen, deren amphoteres Verhalten durch amphotere Ladungsträger in der Membran bestimmt wird, die sich vom Cholesterol ableiten, wie beispielsweise Na-Histidinyl-Cholesterol-hemisuccinat.
Die WO 03/070735 beschreibt Komponenten für weitere pH-sen- sitive Liposomen dieser Art.
Bevorzugt weisen die liposomalen Formulierungen vorteilhaf- te Mischungsverhältnisse auf. Unter den Mischungen dieser Substanzen sind solche bevorzugt, die einen Anteil negati- ver Ladungsträger von nicht mehr als 40 mol% aufweisen. Insbesondere bevorzugt sind solche Mischungen, bei denen der Anteil negativer Ladungsträger zwischen 5 bis 30 mol% liegt.
Unter den Mischungen dieser Substanzen sind solche bevor- zugt, die einen Anteil positiver Ladungsträger von nicht mehr als 40 mol% aufweisen. Insbesondere bevorzugt sind solche Mischungen, bei denen der Anteil positiver Ladungs- träger zwischen 5 und 30 mol% liegt.
Der molare Anteil an der Zusammensetzung der Liposomen- membran beträgt bei den Gerüstlipiden bevorzugt 30 bis 80 %, besonders bevorzugt 40 bis 70 %.
Die erfindungsgemäß bevorzugten Mischungen von Lipiden um- fassen bevorzugt solche, die entweder kein Cholesterol oder zwischen 35 und 50 mol% Cholesterol enthalten. Ganz be- sonders bevorzugt sind Liposomen, die zwischen 35 und 45 mol% Cholesterol enthalten.
Werden amphotere. Lipide zur Bildung der Liposomen eingesetzt, so beträgt der molare Anteil weniger als 40 mol%, bevorzugt 5-30 mol %.
Solche amphoteren Liposomen sind für die Ausführung der Er- findung besonders bevorzugt, da sie im Serum stabil sind und keine Aggregate bilden. Der Offenbarungsgehalt der zu- gehörigen Referenzen, der WO 02 066012, WO 02 066490, WO 02 066489, WO 03 070220, WO 03 070735 werden in die Offenbarung der Beschreibung aufgenommen.
Die Methoden zur Herstellung der wirkstoffhaltigen Liposo- men sind dem Fachmann bekannt und können aus Standardwerken entnommen werden.
Mit besonderem Vorteil werden die Lipide in einem pharma- kologisch akzeptablen Alkohol wie Ethanol, Isopropanol oder 1,2-Propandiol oder auch in DMSO gelöst und unter schnellem Mischen in die wässrige Lösung des Wirkstoffes verdünnt.
Bei geeigneter Prozessführung, beispielsweise bei einer 10-fachen Verdünnung der organischen in die wässrige Phase, entstehen Liposomen im gewünschten Größenbereich zwischen 150 und 500 nm. Es ist dann keine weitere Veränderung der Liposomen durch Homogenisation oder Extrusion notwendig.
Nicht eingeschlossener Wirkstoff kann abgetrennt werden.
Dazu eignen sich Verfahren wie Gelfiltration, Zentrifuga- tion oder auch Dialyse, besonders Tangentialflussdialyse.
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Mittel, die die erfindungsgemäßen liposomalen Formulierungen umfassen. Die erfindungsgemäßen Liposomen werden in einer pharmazeuti- schen Zubereitung formuliert. Diese umfasst die Verwendung und/oder Zumischung von Hilfsstoffen (Stabilisatoren, Anti- oxidantien), die eine gute Verträglichkeit, pharmazeutische Sicherheit und Herstellung und Lagerung unter GMP-Be- dingungen sicherstellen. Dazu gehört beispielsweise die Verwendung von sterilen Salz-, Puffer-und/oder Zucker- lösungen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden in einer thera- peutischen Menge mit einem Organismus in Kontakt gebracht ; in solch einem Falle werden die erfindungsgemäßen Ver- bindungen als pharmazeutisches Mittel oder als Arzneimittel eingesetzt ; demgemäß können diese Begriffe im Kontext der Erfindung synonym verwendet werden. Der Ausdruck thera- peutische Menge bezeichnet wie hierin verwendet eine Menge, die Symptome einer Störung oder responsiven, pathologisch physiologischen Kondition verhindert oder verbessert. In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist die verabreichte Menge ausreichend, eine Entzündung zu verhindern oder zu hemmen. Die Erfindung betrifft demgemäß - wie bereits ausgeführt-pharmazeutische Mittel oder Arz- neimittel, die die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutischen Hilfsstoffen.
Die an einem Gesunden im Falle der Prophylaxe bzw. an einem Patienten im Falle der Therapie zu verwendende Menge an erfindungsgemäßen Verbindungen wird formuliert und die Do- sis gemäß üblicher medizinischer Praxis festgesetzt, wobei die zu behandelnde Störung, der Zustand des einzelnen Patienten, die Verabreichungsstelle, das Verabreichungsver- fahren und andere den behandelnden Ärzten bekannte Faktoren berücksichtigt werden. In ähnlicher Weise hängt die Dosis der verabreichten erfindungsgemäßen Verbindungen von den Eigenschaften der Entzündung ab, von der in vivo Halb- wertszeit erfindungsgemäßen Verbindungen im Plasma wie auch von der Konzentration der erfindungsgemäßen Verbindungen in der Formulierung, dem Verabreichungsweg, der Stelle und der Rate der Dosierung, der klinischen Toleranz des jeweiligen Individuums (Mensch und Tier), der pathologischen Affektion des Patienten und dergleichen, wie es Ärzten bzw. anderen Fachleuten bekannt ist. Es können während einer Abfolge aufeinander folgender Verabreichungen auch unterschiedliche Dosierungen eingesetzt werden.
Es ist zum Beispiel vorgesehen, dass Injektionen (intra- muskulär oder subkutan oder in die Blutgefäße) ein Weg für die therapeutische Verabreichung der erfindungsgemäßen Ver- bindungen, beispielsweise der eingekapselten oder an Träger gebundenen erfindungsgemäßen Verbindungen, sind, obgleich die Zufuhr als Aerosol, über Katheter oder chirurgische Schläuche auch angewendet werden kann. Andere bevorzugte Wege umfassen im Handel erhältliche Vernebler für flüssige Formulierungen und Inhalationen von lyophilisierten oder aerolysierten Verbindungen und Suppositorien für rektale oder vaginale Verabreichung. Die Eignung der gewählten Parameter, zum Beispiel Dosis, Schema, Adjuvanzwahl und dergleichen, kann durch Entnahme von Serum-Aliquoten aus dem Patienten-das heißt dem Mensch oder dem Tier-und Testen im Verlauf der Applikationen bestimmt werden.
Alternativ und begleitend dazu kann die Menge von T-Zellen oder anderen Zellen des Immunsystems auf herkömmliche Weise bestimmt werden, um einen Gesamtüberblick über die Entzündung des Patienten zu erhalten. Zusätzlich kann der klinische Zustand des Patienten auf die gewünschte Wirkung hin beobachtet werden. Da Entzündungen mit anderen Erkrankungen assoziiert sein können, ist es auch möglich, diese zusätzlich mit zu verfolgen.
Im Allgemeinen können sowohl wässrige Formulierungen als auch trockene erfindungsgemäße Verbindungen mit einem Exzipienten vermengt werden, um für eine stabilisierende Wirkung vor der Behandlung beispielsweise mit einem Lö- sungsmittel zu sorgen. Eine wässrige Lösung einer erfin- dungsgemäßen Verbindung kann eine erfindungsgemäße Verbin- dung in Suspension oder eine Lösung sein. Dem Fachmann sind weitere Zubereitungs-, Darreichungs-und Anwendungsformen bekannt, wie zum Beispiel als Gel, Emulsion, Aufgussformu- lierung, Tropfen, Konzentrat, Sirup, Boli, Aerosol, Spray und/oder Inhalat. Die Behandlung der Entzündungen umfasst Prophylaxe, Prävention, Diagnose, Verminderung, Therapie, Verlaufskontrolle und/oder Nachbehandlung.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann in einer Lösung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Konservierungsmittel ein- gebracht sein. Beispiele für geeignete Konservierungsmittel der Suspension bzw. Lösungen umfassen Phenol, Benzyl- alkohol, m-Kresol, Metylparaben, Propylparaben, Benz- alkoniumchlorid und Benzethoniumchlorid in einer solchen Konzentration, dass die konservierende Wirkung eintritt, ohne dass die liposomale Formulierung nachteilig modi- fiziert wird. Im Allgemeinen können die Formulierungen der erfindungsgemäßen Verbindungen Komponenten in Mengen ent- halten sein, die der Herstellung stabiler Formen nicht ab- träglich sind und in Mengen, die für wirksame, sichere pharmazeutische Verabreichungen geeignet sind. Beispiels- weise können andere pharmazeutisch annehmbare, dem Fach- kundigen bekannte Exzipienten einen Teil der erfindungs- gemäßen Verbindungen oder Formulierungen bilden. Diese umfassen beispielsweise Salze, verschiedene Füller, zusätz- liche Pufferagenzien, Chelatbildner, Antioxydanzien, Co- Lösungsmittel und dergleichen.
Dem Fachmann ist bekannt, dass künstliche bzw. natürliche Membranen von Liposomen eine immunstimulierende Wirkung haben können, insbesondere dann, wenn die Komponenten auf die Oberfläche der Liposomen gekoppelt werden oder im In- neren der Liposomen eingeschlossen sind oder einfach nur mit den Liposomen zusammen vermischt werden. Derartige For- mulierungen von Liposomen können zum Beispiel zusammen mit den erfindungsgemäßen Liposomen parentral appliziert wer- den ; selbstverständlich ist es auch möglich, die erfin- dungsgemäßen Liposomen so zu modifizieren, dass sie eine immunstimulierende Wirkung haben. Es ist möglich, derartige Formulierungen mit bekannten Methoden, wie zum Beispiel einem Spray, nasal auf die Schleimhäute zu applizieren.
Eine mit dem Spray vorgenommene therapeutische Behandlung ist bevorzugt für die Behandlung von Entzündungen im Hals- Nasen-Ohren Bereich geeignet. Die liposomale Zusammen- setzung, die zusammen mit der erfindungsgemäßen Zusammen- setzung appliziert ist, kann einen oder mehrere zusätzliche pharmazeutische Träger umfassen, die ausgewählt sind aus oberflächenaktiven Stoffen und Absorptionsförderern wie zum Beispiel Gallensalzen und deren Derivaten, Fusidinsäure und deren Derivaten, Oleinsäure, Lecithin, Lysolecithinen usw., wasserabsorbierenden Polymeren wie zum Beispiel Glycofurol, Polyvinylpyrrolidon, Propylenglycol oder Polyacrylsäure, Gelatine, Cellulose und Derivaten usw. ; Substanzen, welche den enzymatischen Abbau hemmen, wie zum Beispiel Aprotinin usw. ; organischen Lösungsmitteln wie zum Beispiel Alko- holen, zum Beispiel Ethanol, Glycerol, Benzylalkohol usw. ; oder Ethylacetat usw. ; hydrophoben Mitteln wie zum Beispiel pflanzlichem Öl, Sojabohnenöl, Erdnussöl, Kokosnussöl, Maisöl, Olivenöl, Sonnenblumenöl, "Miglyolen"oder deren Mischungen usw. ; pH-regulierenden Mitteln wie zum Beispiel Salpetersäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Citraten usw. ; Konservierungsmitteln und den osmotischen Druck regulieren- den Mitteln wie zum Beispiel Glycerol, Natriumchlorid, Methylparaoxybenzoat, Benzoesäure usw. ; Liposomen-und/oder Emulsionsformulierungen wie zum Beispiel Lecithinen usw. ; mikroverkapselten Formulierungen ; Treibmitteln wie zum Bei- spiel Butan.
Bei den Trägern, die Bestandteil von Arzneimitteln sein können-die die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen-, kann es sich im Sinne der Erfindung auch um Wasser-Öl- Emulsionen wie beispielsweise Montanide, Polylysin, Poly- arginin-Verbindungen oder andere, wie zum Beispiel phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, Wasser, sterile Lösungen und dergleichen mehr.
Das pharmazeutische Mittel im Sinne der Erfindung kann neben den Glucocorticoiden beispielsweise ein akzeptables Salz oder Komponenten dieser umfassen. Hierbei kann es sich beispielsweise um Salze anorganischer Säuren handeln wie zum Beispiel der Phosphorsäure bzw. um Salze organischer Säuren. Weiterhin ist es möglich, dass die Salze frei von Carboxylgruppen sind und von anorganischen Basen abgeleitet wurden wie zum Beispiel Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium oder Eisenhydroxyde oder auch von organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin und andere. Beispiele für flüssige Träger sind sterile wässrige Lösungen, die keine weiteren Materialien oder aktiven Ingredienzien umfassen und beispielsweise Wasser oder solche, die einen Puffer wie zum Beispiel Natrium- phosphat mit einem physiologischen pH umfassen oder eine physiologische Salzlösung bzw. beides, wie zum Beispiel phosphatgepufferte Natriumchloridlösung. Weitere flüssige Träger können mehr als nur ein Puffersalz, wie zum Beispiel Natrium-und Kaliumchlorid, HEPES, Dextrose, Propylenglycol oder andere umfassen. Flüssige Zusammensetzungen der pharmazeutischen Mittel können zusätzlich eine flüssige Phase, jedoch unter dem Ausschluss von Wasser, umfassen.
Beispiele solcher zusätzlichen flüssigen Phasen sind Glycerin, Pflanzenöle, organische Ester oder Wasser-Öl- Emulsionen. Die pharmazeutische Zusammensetzung bzw. das pharmazeutische Mittel enthält typischerweise einen Gehalt von mindestens 0,01 Gew% der erfindungsgemäßen Verbindungen bezogen auf die gesamte pharmazeutische Zusammensetzung.
Die jeweilige Dosis bzw. der Dosisbereich für die Gabe des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittels ist groß genug, um den gewünschten prophylaktischen oder therapeutischen Effekt zu erreichen. Hierbei sollte die Dosis nicht so gewählt werden, dass unerwünschte Nebeneffekte dominieren.
Im Allgemeinen wird die Dosis mit dem Alter, der Konstitu- tion, dem Geschlecht des Patienten variieren sowie selbst- verständlich auch in Bezug auf die Schwere der Erkrankung.
Die individuelle Dosis kann sowohl in Bezug auf die primäre Erkrankung als auch in Bezug auf Eintreten zusätzlicher Komplikationen eingestellt werden. Die exakte Dosis ist durch einen Fachmann mit bekannten Mitteln und Methoden feststellbar, beispielsweise durch die Feststellung des Tumorwachstums in Abhängigkeit der Dosis bzw. in Abhängig- keit des Applikationsschemas oder der pharmazeutischen Trä- ger und ähnlichem. Die Dosis kann hierbei je nach Patient individuell gewählt werden. Beispielsweise kann eine vom Patienten noch tolerierte Dosis des pharmazeutischen Mit- tels eine solche sein, deren Bereich im Plasma oder in einzelnen Organen lokal im Bereich von 0,1 bis 10000 ßM liegt, bevorzugt zwischen 1 und 100 yM, wobei sich die Dosis auf das pharmazeutische Mittel, die liposomale For- mulierung oder die Glucocorticoide beziehen kann. Alter- nativ kann die Dosis auch in Bezug auf das Körpergewicht des Patienten bezogen berechnet werden. Weiterhin ist es jedoch auch möglich, die Dosis nicht in Bezug auf den gesamten Patienten, sondern in Bezug auf einzelne Organe zu bestimmen. Dies wäre beispielsweise dann der Fall, wenn das erfindungsgemäße pharmazeutische Mittel beispielsweise in einem Biopolymer, eingebracht in den jeweiligen Patienten, in der Nähe bestimmter Organe mittels einer Operation platziert wird. Dem Fachmann sind mehrere Biopolymere bekannt, die Liposomen in einer gewünschten Art und Weise freisetzen können. In solch einem Fall wird das thera- peutische Mittel als feste, gelartige oder als flüssige Komposition verabreicht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Träger ausgewählt aus der Gruppe umfassend Füll- mittel, Streckmittel, Bindemittel, Feuchthaltemittel, Sprengmittel, Lösungsverzögerer, Resorptionsbeschleuniger, Adsorbtionsmittel, und/oder Gleitmittel, die so ausgewählt sind, dass sie die erfindungsgemäße liposomale Formulierung nicht beeinträchtigen.
Hierbei handelt es sich bei den Füll-und Streckmitteln be- vorzugt um Stärken, Milchzucker, Rohrzucker, Glukose, Man- nit und Kieselsäure, bei dem Bindemittel, bevorzugt Car- bocymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrroli- don, bei dem Feuchthaltemittel bevorzugt um Glycerin, bei dem Sprengmittel bevorzugt um Agar-Agar, Calciumcarbonat und Natriumcarbonat, bei dem Lösungsverzögerer vorzugsweise um Paraffin und bei dem Resorptionsbeschleuniger bevorzugt um quarternäre Ammoniumverbindungen, bei dem Adsorptionsmittel bevorzugt um Kaolin und Bentonit und bei dem Gleitmittel bevorzugt um Talkum, Calcium-und Magnesiumstearat oder Gemische der aufgeführten Stoffe.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen als Gel, Emulsion, Aufgussformulierung, Tropfen, Konzentrat, Sirup, Boli, Aerosol, Spray und/oder Inhalat zubereitet und/oder in dieser Form angewendet.
Der oder die Wirkstoffe-das heißt die erfindungsgemäßen Verbindungen-können gegebenenfalls mit einem oder mehre- ren der oben angegebenen Trägerstoffe auch in mikrover- kapselter Form vorliegen.
Suppositorien können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen wasserlöslichen oder wasserunlöslichen Träger- stoffe enthalten, zum Beispiel Polyethylenglycole, Fette, zum Beispiel Kakaofett und höhere Ester (zum Beispiel C14- Alkohol mit Gig-Fettsäure) oder Gemische dieser Stoffe).
Salben, Pasten, Cremes und Gele können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe enthalten, zum Bei- spiel tierische und pflanzliche Fette, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyethylenglycole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talkum und Zinkoxid oder Gemische dieser Stoffe.
Sprays können zusätzlich die üblichen Treibmittel, zum Beispiel Chlorfluorkohlenwasserstoffe, enthalten.
Lösungen und Emulsionen können neben dem oder den Wirk- stoffen die üblichen Trägerstoffe wie Lösungsmittel, Lösungsvermittler und Emulgatoren, zum Beispiel Wasser, Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butylen- glykol, Dimethylformamid, Öle, insbesondere Baumwollsaatöl, Erdnussöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Ricinusöl und Sesamöl, Glycerin, Glycerinformal, Tetrahydo-furfurylalkohol und Fettsäureester des Sorbitans oder Gemische dieser Stoffe enthalten. Zur parenteralen Applikation können die Lösungen und Emulsionen auch in steriler und blutisotonischer Form vorliegen.
Suspensionen können neben dem oder den Wirkstoffen die üb- lichen Trägerstoffe wie flüssige Verdünnungsmittel, zum Beispiel Wasser, Ethylalkohol, Propylenglykol, Suspendier- mittel, zum. Beispiel ethoxilierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbit-und Sorbitan-Ester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant oder Gemische dieser Stoffe enthalten.
Die Arzneimittel können in Form einer sterilen injizier- baren Zubereitung, zum Beispiel als sterile injizierbare wässrige oder liposomale Suspension, vorliegen. Diese Sus- pension kann auch im Fachgebiet bekannten Verfahren unter Verwendung geeigneter Dispergier-oder Netzmittel und Sus- pendiermittel formuliert werden. Die sterile injizierbare Zubereitung kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem ungiftigen parenteral verträglichen Verdünnungs-oder Lösungsmittel, zum Beispiel als Lösung in 1,3-Butandiol, sein. Zu den verträglichen Vehikeln und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, gehören Man- nit, Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchlorid- lösung.
Die genannten Formulierungsformen können auch Färbemittel, Konservierungsstoffe sowie geruchs-und geschmacksverbes- serte Zusätze, zum Beispiel Süßmittel, zum Beispiel Saccha- rin, enthalten. Die erfindungsgemäßen Verbindungen. sollen in den aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen vorzugs- weise in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 99,5, vor- zugsweise von etwa 0,5 bis 95 Gew.-W der Gesamtmischung vorhanden sein.
Die aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können außer den erfindungsgemäßen Verbindungen auch weitere phar- mazeutische Wirkstoffe enthalten. Die Herstellung der oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen erfolgt in üb- licher Weise nach bekannten Methoden, zum Beispiel durch Mischen des oder der Wirkstoffe mit dem oder den Träger- stoffen.
Die genannten Zubereitungen können bei Mensch und Tier ent- weder oral, nasal, rektal, regional-zum Beispiel in Ge- lenkbereichen oder ähnliches-parenteral (intravenös, intramuskulär, subkutan), intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, lokal, dermal (Puder, Salbe, Tropfen) und zur Therapie von Entzündungen in Hohlräumen, Körperhöhlen angewendet werden. Als geeignete Zubereitung kommen Injek- tionslösungen, Lösungen und Suspensionen für die orale Therapie, Gele, Aufgussformulierungen, Emulsionen, Salben oder Tropfen in Frage. Zur lokalen Therapie können ophtal- mologische und dermatologische Formulierungen oder Lösungen verwendet werden. Bei Tieren kann die Aufnahme auch über das Futter oder Trinkwasser in geeigneten Formulierungen erfolgen. Ferner können Gele, Tabletten, Retard-Tabletten, Premixe, Konzentrate, Boli, Kapseln, Aerosole, Sprays, Inhalate bei Mensch und Tier angewendet werden. Ferner kön- nen die erfindungsgemäßen Verbindungen in andere Träger- materialien wie zum Beispiel Kunststoffe, (Kunststoffketten zur lokalen Therapie), Kollagen oder Knochenzement einge- arbeitet werden.
Die Wirkstoffmenge, das heißt die Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung, die mit den Trägermaterialien kombiniert wird, um eine einzige Dosierungsform zu erzeugen, wird von dem Fachmann in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Wirt, von der zu behandelnden Entzündung und der besonderen Verabreichungsart variieren können. Nach Besserung des Zustandes eines Wirts bzw. eines Patienten kann der Anteil der wirksamen Verbindung in der Zubereitung so geändert werden, dass eine Erhaltungsdosis vorliegt.- Anschließend kann die Dosis oder Frequenz der Verabreichung oder beides als Funktion der Symptome auf eine Höhe verringert werden, bei der der verbesserte Zustand bei- behalten wird. Wenn die Symptome auf das gewünschte Niveau gelindert worden sind, sollte die Behandlung aufhören.
Patienten können jedoch eine Behandlung mit Unterbrechung auf Langzeitbasis nach beliebigem Wiederauftreten von Erkrankungssymptomen benötigen. Demgemäß ist der Anteil der Verbindungen, das heißt ihre Konzentration, in der Gesamtmischung der pharmazeutischen Zubereitung ebenso wie ihre Zusammensetzung oder Kombination variabel und kann vom Fachmann aufgrund seines Fachwissens modifiziert und angepasst werden.
Dem Fachmann ist bekannt, dass die erfindungsgemäßen Ver- bindungen mit einem Organismus, bevorzugt einem Menschen oder einem Tier, auf verschiedenen Wegen in Kontakt ge- bracht werden können. Weiterhin ist dem Fachmann bekannt, dass insbesondere die pharmazeutischen Mittel in verschie- denen Dosierungen appliziert werden können. Die Applikation sollte hierbei so erfolgen, dass die Entzündung möglichst effektiv bekämpft wird bzw. der Ausbruch einer solchen Krankheit in einer prophylaktischen Gabe verhindert wird.
Die Konzentration und die Art der Applikation kann vom Fachmann durch Routineversuche eruiert werden. Bevorzugte Applikationen der erfindungsgemäßen Verbindungen sind die orale Applikation in Form von Saft, Tropfen, Kapseln oder ähnlichem, die rektale Applikation in Form von Zäpfchen, Lösungen und ähnlichem, parenteral in Form von Injektionen, Infusionen und Lösungen, Inhalation von Dämpfen und Aerosolen sowie lokal in Form von Salben, Pflastern, Umschlägen, Spülungen und ähnlichem. Bevorzugt erfolgt das In-Kontakt-Bringen der erfindungsgemäßen Verbindungen prophylaktisch oder therapeutisch. Bei einer prophylaktischen Gabe soll die Ausbildung der Entzündung zumindest dergestalt verhindert werden, dass eine weitere Entzündung stark vermindert wird oder nahezu vollständig eliminiert wird. Bei einem therapeutischen In-Kontakt- Bringen liegt bereits eine manifeste Entzündung des Patienten vor und die bereits im Körper vorhandenen Entzündungsherde sollen gehemmt werden. Weitere hierfür bevorzugte Applikationsformen sind beispielsweise die subkutane, die sublinguale, die intravenöse, die intra- muskuläre, die intraperitoneale und/oder die topische.
Neben den bereits ausgeführten Konzentrationen bei der An- wendung der erfindungsgemäßen Verbindungen können in einer bevorzugten Ausführungsform die Verbindungen weiterhin in einer Gesamtmenge von 0,005 bis 500 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden eingesetzt werden, bevorzugt von 0.05 bis 100 mg/kg Körpergewicht. Hierbei handelt es sich vorteilhafterweise um eine therapeutische Menge, die verwendet wird, um die-Symptome einer Störung oder responsiven, pathologisch physiologischen Kondition zu verhindern oder zu verbessern. Die verabreichte Menge ist ausreichend, um die Entzündung zu hemmen.
Selbstverständlich wird die Dosis vom Alter, der Gesundheit und dem Gewicht des Empfängers, dem Grad der Krankheit, der Art einer notwendigen gleichzeitigen Behandlung, der Häufigkeit der Behandlung und der Art der gewünschten Wir- kungen und der Nebenwirkungen abhängen. Die tägliche Dosis von 0,005 bis 500 mg/kg Körpergewicht kann einmalig oder mehrfach angewendet werden, um die gewünschten Ergebnisse zu erhalten. Die Dosishöhen pro Tag sind bei der Vorbeugung und bei der Behandlung anwendbar. Typischerweise werden insbesondere pharmazeutischen Mittel zur etwa 1-bis 10- maligen Verabreichung pro Tag oder alternativ oder zu- sätzlich als kontinuierliche Infusion verwendet. Sie können aber auch in Abständen von 2-10 Tagen verabreicht werden.
Solche Verabreichungen können als chronische oder akute Therapie angewendet werden. Die Wirkstoffmengen, die mit den Trägermaterialien kombiniert werden, um eine einzelne Dosierungsform zu erzeugen, können in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Wirt und der besonderen Verabreichungsart selbstverständlich variieren. Bevorzugt ist es, die Tar- getsdosis auf 2 bis 5 Applikationen zu verteilen, wobei bei jeder Applikation 1 bis 2 Tabletten, Kapseln, Lösungen mit einem Wirkstoffgehalt von 0,05 bis 500 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden. Selbstverständlich ist es möglich, den Wirkstoffgehalt auch höher zu wählen, beispielsweise bis zu einer Konzentration bis 5000 mg/kg. Beispielsweise können Kapseln, die die erfindungsgemäßen Liposomen umfassen, auch retardiert sein, wodurch sich die Anzahl der Applikationen pro Tag auf 1 bis 3 vermindert oder es können mehrere Tage dazwischen liegen. Der Wirkstoffgehalt der retardierten Kapseln kann 3 bis 3000 mg betragen.
Wenn der Wirkstoff-wie ausgeführt-durch eine Injektion verabreicht wird, ist es bevorzugt, 1-bis 10-mal pro Tag bzw. durch Dauerinfusion den Wirt mit den erfindungsgemäßen Verbindungen in Kontakt zu bringen, wobei Mengen von 0,04 bis 4000 mg pro Tag bevorzugt sind. Die bevorzugten Gesamt- mengen pro Tag haben sich in der Humanmedizin und in der Veterinärmedizin als vorteilhaft erwiesen. Es kann erfor- derlich sein, von den genannten Dosierungen abzuweichen und zwar in Abhängigkeit von der Art und dem Körpergewicht des zu behandelnden Wirts, der Art und der Schwere der Erkran- kung, der Art der Zubereitung der Applikation des Arznei- mittels sowie dem Zeitraum bzw. dem Intervall, innerhalb welchem die Verabreichung erfolgt. So kann es in einigen Fällen bevorzugt sein, den Organismus mit weniger als den genannten Mengen in Kontakt zu bringen, während in anderen Fällen die angegebene Wirkstoffmenge überschritten werden muss. Die Festlegung der jeweils erforderlichen optimalen Dosierungen und der Applikationsart der Wirkstoffe kann durch den Fachmann aufgrund seines Fachwissens leicht erfolgen.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Einzelgabe von 0,01 bis 80, insbesondere von 0,3 bis 40 mg/kg Körpergewicht eingesetzt. Wie auch die Gesamtmenge pro Tag kann auch die Menge der Einzelgabe pro Applikation von dem Fachmann aufgrund seines Fachwissens variiert wer- den. Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen können in den genannten Einzelkonzentrationen und Zubereitungen zu- sammen mit dem Futter bzw. mit Futterzubereitungen oder mit dem Trinkwasser auch in der Veterinärmedizin gegeben wer- den.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die erfindungsgemäßen Verbindungen mit mindestens einem anderen bekannten pharmazeutischen Mittel eingesetzt werden. Das heißt, die erfindungsgemäßen Verbindungen kön- nen in einer prophylaktischen oder therapeutischen Kombi- nation in Verbindung mit den bekannten Arzneimitteln ein- gesetzt werden. Diese Kombinationen können gemeinsam, zum Beispiel in einer einheitlichen pharmazeutischen Formu- lierung verabreicht werden, oder getrennt, zum Beispiel in Form einer Kombination aus Tabletten, Injektion oder an- deren Medikamenten, die zu gleichen oder zu unterschied- lichen Zeiten verabreicht werden, mit dem Ziel, die ge- wünschte prophylaktische oder therapeutische Wirkung zu erzielen. Bei diesen bekannten Mitteln kann es sich um Mittel handeln, die die Wirkung der erfindungsgemäßen Ver- bindungen steigern.
Selbstverständlich ist es auch möglich, die erfindungs- gemäßen Verbindungen, insbesondere die pharmazeutischen Mittel, allein oder zusammen mit anderen Mitteln in einer Therapie, beispielsweise in einer Kombinationstherapie, als regionale Therapie einzusetzen.
Selbstverständlich können die erfindungsgemäßen Verbin- dungen in Kombination mit anderen bekannten Anti- Entzündungsmitteln verwendet werden. Dem Fachmann sind der- artige Mittel bekannt. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können demgemäß mit allen herkömmlichen Mitteln, ins- besondere anderen Arzneimitteln, verabreicht werden, die für die Verwendung verfügbar sind, entweder als einzelne Arzneimittel oder in Kombination von Arzneimitteln. Sie können allein verabreicht werden oder in Kombination mit diesen.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in Substanz oder als wässrige Lösung vorliegen zusammen mit anderen Ma- terialen wie Konservierungsmitteln, Puffersubstanzen, Mit- teln die zur Einstellung der Osmolarität der Lösung vor- gesehen sind etc.
Die Erfindung betrifft auch einen Kit und dessen Verwendung in der Medizin. Es ist bevorzugt, die erfindungsgemäßen Verbindungen oder den Kit, der diese umfasst, in einer Kombinationstherapie, insbesondere zur Behandlung von Ent- zündungen, zu verwenden.
Die erfindungsgemäßen Liposomen finden Anwendung bei der systemischen Behandlung von inflammatorischen und Auto- immun-Erkrankungen mit Cortikoiden.
Bevorzugte Indikationen sind die Autoimmunerkrankungen.
Dazu gehören unter anderem die systemischen Vaskulitiden, Lupus erythematodes, Polymyositis, Polymyalgia rheumatica, rheumatisches Fieber, rheumatische rheumatoide Arthritis, systemische Sklerose, reaktive Arthritiden, Neurodermitis, Psoriasis, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Multiple Sklerose, Asthma bronchiale und andere mehr.
Die erfindungsgemäßen Liposomen, pharmazeutischen Mittel und/oder der Kit können zur Prophylaxe oder Behandlung von pathogenen Modifikationen eingesetzt werden, bevorzugt von (i) Entzündungen, besonders bevorzugt von (ii) Autoimmun- erkrankungen, ganz besonders bevorzugt von (iii) Arthritis.
(i) Entzündungen im Sinne der Erfindung sind die vom Binde- gewebe und den Blutgefäßen getragene Reaktion des Organis- mus auf einen äußeren oder innerlich ausgelösten Ent- zündungsreiz mit dem Zweck, diesen zu beseitigen oder zu inaktivieren und die reizbedingte Gewebsschädigung zu repa- rieren. Auslösend wirken mechanische Reize (Fremdkörper, Druck, Verletzung) und andere physikalische Faktoren (ioni- sierende Strahlen, UV-Licht, Wärme, Kälte), chemische Stof- fe (Laugen, Säuren, Schwermetalle, bakterielle Toxine, Allergene und Immunkomplexe) sowie Erreger (Mikroorganismen, Würmer, Insekten) bzw. krankhafte Stoffwechselprodukte, entgleiste Enzyme, bösartige Tumoren. Das Geschehen beginnt mit einer kurzen Arteriolenverengung (durch Adrenalin- wirkung) mit Mangeldurchblutung und Gewebsalteration, gefolgt von der Entwicklung der klassischen örtlichen Ent- zündungszeichen (Kardinalsymptome ; nach GALEN und CELSUS), das heißt von Rötung (= Rubor ; Gefäßerweiterung durch Histamin), Wärme (= Calor ; durch örtliche Stoffwechsel- steigerung), Schwellung (= Tumor ; durch Austritt eiweiß- reicher Flüssigkeit aus den-unter anderem durch Histamin-veränderten Gefäßwänden, unterstützt durch die verlangsamte Blutzirkulation im Sinne der Prästase bis Stase), Schmerz (= Dolor ; als Folge der erhöhten Gewebs- spannung und schmerzauslösender Entzündungsprodukte, zum Beispiel Bradykinin) und Funktionsstörung (= Functio laesa). Der Vorgang wird ergänzt durch Störung des Elektrolythaushaltes (Transmineralisation), Einwanderung neutrophiler Granulozyten und Monozyten durch die Gefäß- wände (s. a. Leukotaxis), letzteres mit dem Zweck, den Ent- zündungsreiz und geschädigte bis neukrotische Zellen zu beseitigen (Phagozytose) ; ferner wandern Lymphozyten-Effek- torzellen ein, die zur Bildung spezifischer Antikörper gegen den Entzündungsreiz führen (Immunreaktion), sowie Eosinophile (in der Heilungsphase bzw. -sehr frühzeitig- bei allergisch-hyperergischem Geschehen). Durch die bei der Reaktion erfolgende Aktivierung des Komplementsystems werden Bruchstücke (C3a und C5a) dieses Systems frei, die - wie das Histamin und Bradykinin-als Mediatoren der Entzündung wirken, und zwar im Sinne der Anregung der Chemotaxis der zitierten Blutzellen ; ferner wird die Blutgerinnung aktiviert. In der Folge tritt eine Schädigung (Dystrophie und Koagulationsnekrose) des zugeordneten Organparenchyms ein. Der Gesamtorganismus reagiert je nach Intensität und Art der Entzündung mit Fieber, Stress (s. a.
Adaptationssyndrom), Leukozytose und Veränderungen in der Zusammensetzung der Plasmaproteine (Akute-Phase-Reaktion), die zu einer beschleunigten Blutkörperchensenkungsreaktion führen. Bevorzugte Entzündungen im Sinne der Erfindung sind die eitrige, die exudative, die fibrinöse, die gangränes- zierende, die granulomatöse, die hämorrhagische, die katarrhalische, die nekrotisierende, die proliferative oder produktive, die pseudomembranöse, die seröse, die spezi- fische und/oder die ulzeröse Entzündungen.
(ii) Autoimmunerkrankungen im Sinne der Erfindung sind Krankheiten, die ganz oder teilweise auf die Bildung von Autoantikörpern und deren schädigende Einwirkung auf den Gesamtorganismus bzw. Organsysteme, das heißt auf Auto- aggression zurückzuführen sind. Eine Klassifikation ist als organspezifische, intermediäre und/oder systemische Auto- immunerkrankung möglich. Bevorzugte organspezifische Auto- immunerkrankungen sind HASHIMOTO Thyreoiditis, primäres Myxödem, Thyreotoxikose (BASEDOW Krankheit), perniziöse Anämie, ADDISON Krankheit, Myasthenia gravis und/oder juve- niler Diabetes mellitus. Bevorzugte intermediäre Auto- immunkrankheiten sind GOODPASTURE Syndrom, autoimmune hämo- lytische Anämie, autoimmune Leukopenie, idiopathische Thrombozytopenie, Pemphigus vulgaris, sympathische Ophthal- mie, primäre biliäre Zirrhose, Autoimmunhepatitis, Colitis ulcerosa und/oder SJÖGREN Syndrom. Bevorzugte systemische Autoimmunkrankheiten sind rheumatoide Arthritis, rheuma- tisches Fieber, systemischer Lupus erythematodes, Dermato- myositis/Polymyositis, progressive systemische Sklerose, WEGENER Granulomatose, Panarteriitis nodosa und/oder Hyper- sensitivitätsangiitis. Typische Autoimmunkrankheiten sind Thyreotoxikose, Schilddrüsen-bedingtes Myxödem, HASHIMOTO Thyreoiditis, generalisierte Endokrinopathie, perniziöse Anämie, chronische Gastritis Typ A, Krankheiten einzelner oder aller korpuskulären Elemente des Blutes (zum Beiapiel autoimmunhämolytische Anämie, idiopath. Thrombozytopenie bzw. -pathie ; idiopath. Leukopenie bzw. Agranulozytose), Pemphigus vulgaris und Pemphigoid, sympathische Ophthalmie und manche Uveitis-Formen, primär biliäre Leberzirrhose und chronisch aggressive Autoimmunhepatitis, Diabetes mellitus Typ I, CROHN Krankheit und Colitis ulcerosa, SJÖGREN Syn- drom, ADDISON Krankheit, Lupus erythematodes disseminatus und als diskoide Form dieser Krankheit, als Dermatomyositis und Sklerodermie, rheumatoide Arthritis (= primär-chro- nische Polyarthritis), Antiglomerulusbasalmembran-Nephri- tis. Grundlage sind eine aggressive Immunreaktion infolge Zusammenbruchs der Immuntoleranz gegenüber Selbst-Dertermi- nanten und eine Abnahme der Aktivität der T-Suppressor zellen (mit Lymphozytenmarker T 8) bzw. ein Übergewicht der T-Helferzellen (mit Lymphozytenmarker T 4) über die Sup- pressorzellen ; ferner ist die Bildung von Autoantigenen möglich, zum Beispiel durch Verbindung von Wirtsproteinen mit Haptenen (zum Beispiel Arzneimittel), durch onto- genetisches Gewebe, das sich erst nach Entwicklung der Selbsttoleranz entwickelt und für durch Änderungen der Konformation der Proteine demaskierte Proteinkomponenten im Zusammenhang zum Beispiel mit Infektion durch Viren oder Bakterien ; ferner für im Zusammenhang mit Neoplasien ent- standene neue Proteine.
(iii) Arthritis im Sinne der Erfindung sind Gelenk- entzündungen als Oberbegriff für primäre bzw. sekundäre entzündliche Gelenkerkrankungen. Bevorzugte Arthritis- erkrankungen sind die juvenile chronische, die A. mutilans, die paraneoplastische, die A. psoriatica, die reaktive und/oder die rheumatoide Arthritis.
Auch zur Unterdrückung der Abstoßung von Transplantaten oder bei der Behandlung des Typ-I-Diabetes können liposo- male Formulierungen von Glucocorticoiden mit Vorteil ver- wendet werden.
Eine ganz besonders bevorzugte Indikation ist die rheuma- thische Arthritis.
So wird bei gleicher Wirkstoffmenge ein erheblich besserer therapeutischer Effekt beobachtet. Eine antigeninduzierte Arthritis in Ratten konnte mit 0,375 mg liposomalem Dexa- methasonphosphat pro kg Körpergewicht nahezu vollständig unterdrückt werden. Tiere, die eine identische Dosis des unverpackten Wirkstoffs erhielten, entwickelten nach kurzer Besserung alle Symptome des Tiermodells.
Im Folgenden soll die Ausführung der erfinderischen Lehre an einigen Beispielen verdeutlicht werden, ohne dass sie auf diese Beispiele beschränkt ist.
Beispiel 1 Herstellung Dexamethason-Phosphat gefüllter Liposomen Ein Gemisch aus 50 mol% DPPC, 10 mol% DPPG und 40 mol% Chol wird in Chloroform gelöst und anschließend im Rotations- verdampfer im Vakuum vollständig getrocknet.
Der Lipidfilm wird mit so viel Dexamethason-Phosphat-Lösung (25 mg/ml Dexamethason-Phosphat in 10 mM Hepes, 150 mM NaCl pH 7.5) versetzt, dass eine 100 mM Suspension entsteht. An- schließend wird diese Suspension für 45 Minuten im Wasser- bad bei 50 °C unter Rotieren hydratisiert und für weitere 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Danach wird die Lösung eingefroren.
Nach dem Auftauen werden die Liposomen mehrfach durch eine Membran mit einer Porenweite von 400 nm extrudiert. Die Ab- trennung des nicht eingeschlossenen Dexamethason-Phosphats erfolgt über Gelfiltration.
Beispiel 2 Bestimmung der Freisetzung von Dexamethason-Phosphat Liposomen wurden wie in Beispiel 1 hergestellt und mit Puf- fer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl pH 7.5) auf eine Konzentration von 12 mM Lipid verdünnt. Anschließend werden sie bei 37 °C inkubiert. Aliquots dieser Inkubationslösung werden zu de- finierten Zeitpunkten (vergleiche nachfolgende Tabelle) entnommen. Die entnommenen Aliquots werden mittels RP-HPLC auf ihren Gehalt an Dexamethason-Phosphat vermessen.
Formu-Lipidmol % 024120 lierung Stunden Stunden Stunden A DPPC/DPPG/Chol 50 : 10 : 40 1, 1 6, 0 7, 3 Tabelle 1 Freisetzung von Dexamethason-Phosphat zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Inkubation bei 37 °C in Puffer in % der eingeschlossenen Menge Die Liposomen zeigen über den untersuchten Messzeitraum eine hinreichende Stabilität. Über einen Zeitraum von 5 Ta- gen werden weniger als 8 % des eingeschlossenen Wirkstoffs freigesetzt.
Beispiel 3 Einsatz von liposomalem Dexamethason-Phosphat In den Versuchstieren (Ratten) wurde entsprechend Buchner ("Behandlung der antigeninduzierten Arthritis der Ratte mit Anti-Makrophagenprinzipien und monoklonalen Anti-CD4 Anti- körpern", Dissertation 1996 an der Friedrich-Alexander-Uni- versität Erlangen-Nürnberg, S. 129) eine antigeninduzierte Arthritis ausgelöst.
Die Arthritis wurde am Tag 0 entsprechend Buchner durch intraartikuläre Injektion des Antigens in den Synovialspalt im rechten Knie ausgelöst. Die arthritischen Tiere wurden 6,24 und 48 Stunden nach Induktion der Arthritis intra- venös mit liposomalem Dexamethason-Phosphat (Formulierung A 3,75 mg/kg) behandelt. Als Kontrolle dienen freies Dexa- methason-Phosphat (Formulierung K, ebenfalls 3,75 mg/kg) und physiologische Salzlösung (Saline). Die Wirkung der Probengabe wurde anhand folgender Parameter ermittelt : - Bestimmung der Gelenkschwellung (vgl. Figur 1) - histologische Begutachtung von Entzündungsparametern und Parametern der Gelenkknorpelzerstörung (vgl. Figur 2 und Tabelle 2) Formulierung Grad der Grad der Knorpelzerstörung Gelenkentzündung Saline 4, 0 5, 5 Formulierung K 2, 75 3,5 Formulierung A 0, 25 0,25 Tabelle 2 Grad der Gelenkknorpelzerstörung und Gelenkentzündung der arthritischen Tiere nach Behandlung 0-keine Veränderungen im Vergleich zum gesunden Knie 6 - starke Veränderungen im Vergleich zum gesunden Knie Sowohl Gelenkknorpelzerstörung als auch Entzöndungsreak- tionen werden durch Behandlung mit liposomalem Dexametha- son-Phosphat wirksam verringert. Freier Wirkstoff in der angegebenen Konzentration ist erheblich schlechter wirksam.
Beispiel 4 Einsatz von liposomalem Dexamethason-Phosphat zur Dosis- reduktion Eine Arthrits wurde analog Beispiel 3 an Ratten ausgelöst und diese mit folgenden Formulierungen behandelt, die nur ein Zehntel der in Beispiel 3 angegebenen Dosis Dexa- methason-Phosphat enthielten : Formulierung A 25 gg = 0,375 mg/kG KG Formulierung K 25 gg = 0,375 mg/kG KG Die gemessenen Gelenkschwellungen werden auch in der Figur 1 dargestellt. Ein fast gleicher therapeutischer Effekt ist auch mit der verringerten Dosis festzustellen, die Gelenk- schwellung bildet sich bei Formulierung A nach etwa 3 Tagen vollständig zurück, was bei Formulierung K nicht auftritt.
Beispiel 5 Visualiserung der Liposomenverteilung im Körper Als Label wurde der Fluoreszenzfarbstoff Cy5. 5'm (Amersham Bioscience) eingesetzt, der ein Anregungsmaximum bei 675 nm und ein Fluoreszenzmaximum bei 694 nm, das heißt im. nahen Infrarot hat und durch Bestrahlung durch die Haut angeregt werden kann. Cy5. 5""-BSA wurde durch Kopplung des Cy5. 5'm- NHS-Esters an BSA nach dem Protokoll von Amersham-Bio- science erhalten.
Mit Cy5. 5-BSA gefüllte Liposomen wurden in der Zusammen- setzung DPPC/DPPG/Chol 50 : 10 : 40 analog Beispiel 1 herge- stellt.
- nicht eingeschlossenes Cy5. 5 wurde durch Waschen (Hepes 10mM, mit 150 mM NaCl) und Sedimentation (65000 rpm mit Beckman Rotor 100.4, 40 min, bei 21°C) abgetrennt und die Liposomen mit physiologischer Kochsalzlösung auf 6,5 mM im Lipid verdünnt (Gehalt an Cy5. 5 TM : 8 nmol/mL).
-Versuchstiere : Mäuse mit etablierter AIA (antigen-indu- zierter Arthritis), analog wie im vorherigen Beispiel beschrieben.
Am 7. Tag nach Auslösung der Arthritis wurde den Tieren intravenös in die Schwanzvene einmal 100 yL liposomal verkapseltes Cy5. 5 appliziert. die Fluoreszenzmessung erfolgte nach 6 Stunden mit NIR- Fotografie (Nah-Infarot), dabei wurden arthritisches und gesundes Kniegelenk getrennt vermessen.
Figur 3 zeigt als helle Stellen, Orte, an denen eine An- reicherung des Farbstoffes Cy5. 5 stattgefunden hat. Die Signalstärken sind in etwa wie folgt : 900 im arthritischen Gelenk ; 600 im gesunden Gelenk ; 2500 in Leber und Milz.
Durch Messung der Zunahme des Fluoreszenzsignals konnte die Aufnahme der Liposomen in die Gelenke in einer Zeitreihe verfolgt werden.
Dies wird in Figur 4 gezeigt. Man erkennt, dass im arthri- tischen Gelenk für den Zeitraum der ersten 12 bis 24 Stunden eine stärkere Anreicherung des Cy5. 5 erfolgt als im gesunden Gelenk.
Beispiel 6 Herstellung Dexamethason-Phosphat gefüllter amphoterer Liposomen Ein Gemisch aus 60 mol% POPC, 20 mol% MoChol und 20 mol% Chems wird in Chloroform gelöst und anschließend im Ro- tationsverdampfer im Vakuum vollständig getrocknet.
Der Lipidfilm wird mit so viel Dexamethason-Phosphat-Lösung (25 mg/ml Dexamethason-Phosphat in 10 mM Hepes, 150 mM NaCl pH 7.5) versetzt, dass eine 100 mM Suspension entsteht. An- schließend wird diese Suspension für 45 Minuten im Wasser- bad bei 50 °C unter Rotieren hydratisiert und für weitere 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Danach wird die Lösung eingefroren.
Nach dem Auftauen werden die Liposomen mehrfach durch eine Membran mit einer Porenweite von 400 nm extrudiert. Die Abtrennung des nicht eingeschlossenen Dexamethason-Phospha- tes erfolgt über Gelfiltration.
Es werden analog folgende mit Dexamethason-Phosphat gefüll- ten Liposomen hergestellt : Lipid mol% POPC/MoChol/Chems 60 : 20 : 20 POPC/HisChol/Chems 60 : 20 : 20 POPC/DOTAP/Chems 60 : 10 : 30 POPC/HistChol/Chol 60 : 20 : 20 DPPC/AC/Chol 50 : 10 : 40 Tabelle 3 Beispiele möglicher Liposomenformulierungen für den Ein- schluss von wasserlöslichen Glucocorticoiden.
Beispiel 7 Bestimmung der Freisetzung von Dexamethason-Phosphat aus amphoteren Liposomen Liposomen wurden wie in Beispiel 6 hergestellt und mit Puf- fer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl pH 7.5) auf eine Konzentration von 12 mM Lipid verdünnt. Anschließend werden sie bei 37 °C inkubiert. Aliquots dieser Inkubationslösung werden zu de- finierten Zeitpunkten (vgl. nachfolgende Tabelle) ent- nommen. Die entnommenen Aliquots werden mittels RP-HPLC auf ihren Gehalt an Dexamethason-Phosphat vermessen.
Formu-Llpid mol 0 24 120 lierung Stun-Stunden Stun- den den POPC/MoChol/Chems 60 : 20 : 20 4, 6 10, 5 10, 0 B POPC/HisChol/Chems 60 : 20 : 20 6,7 14,1 10,8 C POPC/DOTAP/Chems 60 : 10 : 30 4,4 4, 2- POPC/HistChol/Chol 60 : 20 : 20 8,7 7, 0- DPPC/AC/Chol 50 : 10 : 40 1,7 7,8 7,4 Tabelle 4 Freisetzung von Dexamethason-Phosphat zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Inkubation bei 37 °C in Puffer in % der eingeschlossenen Menge Die unterschiedlichen Liposomen zeigen über den untersuch- ten Messzeitraum eine hinreichende Stabilität. Über einen Zeitraum von 5 Tagen werden weniger als 6 %, oft weniger als 4 % des eingeschlossenen Wirkstoffs freigesetzt.
Beispiel 8 Einsatz von Dexamethason-Phosphat formuliert in amphoteren Liposomen In den Versuchstieren wurde analog Beispiel 3 eine anti- geninduzierte Arthritis ausgelöst. Die Arthritis wurde am Tag 0 durch intraartikuläre Injektion des Antigens in den Synovialspalt im rechten Knie ausgelöst. Die arthritischen Tiere wurden 6,24 und 48 Stunden nach Induktion der Arthritis intravenös mit liposomalem Dexamethason-Phosphat (Formulierung B, C, je 3,75 mg/kg, nach Tabelle 4) be- handelt. Als Kontrolle dienen freies Dexamethason-Phosphat (Formulierung K, ebenfalls 3,75 mg/kg) und physiologische Salzlösung (Saline). Die Wirkung der Probengabe wurde an- hand folgender Parameter ermittelt : - Bestimmung der Gelenkschwellung (vgl. Figur 5) - histologische Begutachtung von Entzündungsparametern und Parametern der Gelenkknorpelzerstörung (vgl Figur 2 und Tabelle 5) Formulierung Grad der Grad der Knorpelzerstörung Gelenkentzündung Saline 4, 0 5, 5 Formulierung K 2, 75 3,5 Formulierung B 0 0,25 Formulierung C 1, 0 1,5 Tabelle 5 Grad der Gelenkknorpelzerstörung und Gelenkentzündung der arthritischen Tiere nach Behandlung 0-keine Veränderungen im Vergleich zum gesunden Knie 6-starke Veränderungen im Vergleich zum gesunden Knie Sowohl Gelenkknorpelzerstörung als auch Entzündungsreak- tionen werden durch Behandlung mit liposomalem Dexa- methason-Phosphat wirksam verringert. Freier Wirkstoff in der angegebenen Konzentration ist erheblich schlechter wirksam.
Beispiel 9 Dosisreduktion Eine Arthrits wurde analog Beispiel 8 an Ratten ausgelöst und diese mit folgenden Formulierungen behandelt, die nur ein Zehntel der in Beispiel 8 angegebenen Dosis Dexa- methason-Phosphat enthielten : Formulierung Bq25 yg = 0,375 mg/kG KG Formulierung K 25 yg = 0,375 mg/kG KG Die gemessenen Gelenkschwellungen werden auch in der Figur 5 dargestellt. Ein fast gleicher therapeutischer Effekt ist auch mit der verringerten Dosis festzustellen, die Gelenk- schwellung bildet sich bei Formulierung B nach etwa 3 Tagen vollständig zurück, was bei Formulierung K nicht auftritt.
Figurenbeschreibung Figur 1 Gelenkschwellung der arthritischen Tiere über den Untersuchungszeitraum von 21 Tagen nach Auslösung der Arthritis im rechten Knie im Vergleich zum gesunden linken Knie Figur 2 Histologische Schnitte der arthritischen Kniegelenke.
Hämatoxylin/Eosin-Färbung, 92fache Vergrößerung K-Formulierung K, starke Entzündung und Knorpel-und Knochendestruktion A-Formulierung A, geringfügig entzündliche Infiltration C-Formulierung C, keine Entzündungsreaktion Figur 3 Infrarotfluoreszenz einer Ratte, die mit Cy5. 5'"-BSA gefüll- ten Liposomen der Formulierung DPPC/DPPG/Chol 50 : 10 : 40 be- handelt wurde.
Figur 4 Vergleich der zeitlichen Anreicherung der Liposomen im arthrithischen zum nicht arthrithischen Gelenk.
Figur 5 Gelenkschwellung der arthritischen Tiere über den Untersuchungszeitraum von 21 Tagen nach Auslösung der Arthritis im rechten Knie im Vergleich zum gesunden linken Knie : Formulierung 3 HisChol = Formulierung B Formulierung 5 DOTAP = Formulierung C Formulierung DXM-Phosphat = Formulierung K Abkürzungen : HistChol Na-Histidinyl-Cholesterolhemisuccinat DOTAP N- [1- (2, 3-Dioleoyloxy) propyl]-N, N, N- trimethylammonium MoChol 4- (2-Aminoethyl)-Morpholino- Cholesterolhemisuccinat HisChol Histaminyl-Cholesterolhemisuccinat AC Palmitoylcarnosin (Acylcarnosin) Chems Cholesterylhemisuccinat DPPC Dipalmitoylphosphatidylcholin DPPG Dipalmitoylphosphatidylglycerol POPC Palmitoyloleoylphosphatidylcholin Chol Cholesterol BSA Rinderserumalbumin Literatur Mizushima, Y. ; Hamano, T. ; Yokoyama, K. (1982) : Tissue distribution and anti-inflammatory activity of corti- costeroids incorporated in lipid emulsion. Ann Rheum Dis ; 41 (3) : 263-267 Yokoyama, K. ; Okamoto, H. ; Watanabe, M. ; Suyama, T. ; Mizushima, Y. (1985) : Development of a corticosteroid incorporated in lipid microspheres (liposteroid). Drugs Exp Clin Res ; 11 (9) : 611-620 Bonanomi, M. H. ; Velvart, M. ; Weder, H. G. (1987) : Fate of different kinds of liposomes containing dexamethasome palmitate after intra-articular injection into rabbit joints. J Microencapsul ; 4 (3) : 189-200 Loftsson, T. & Stefansson, E. (2002) : Cyclodextrins in eye drop formulations : enhanced topical delivery of corticosteroids to the eye. Acta Ophthalmol Scand ; 80 (2) : 144-150 Yano, H. ; Hirayama, F. ; Kamada, M. ; Arima, H. ; Uekama, K.
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Complex of active cpd. With receptor, e. g. for rendering hydrophobic drugs hydrophilic WO 94/07466 (Liposome Technology Inc. ) : Treatment of inflamed tissue-using liposomes contg. a lipid derivati- sed with polyethylene glycol entrapping a therapeutic cpd.
DE 27 12 030 (Imperial Chem Ind., 1977) : Antiinflammatory medicaments based on liposomes-contg. a lipophilically subst. steroid

We claim
1. A liposomal formulation of water-soluble glucocorticoids and phospholipids wherein water soluble glucocorticoids are present in the interior aqueous phase of the lipo-some and which in the plasma or tissue is in a concentration in the range of 0.1 to 10.000µM and the liposome have a size between 150 and 500 nm; phospholipids has a content of negative charge carrier of no higher than 20 mole-% and a cholesterol content between 35 and 50 mole % or the formulation is an amphoteric liposome and free from any amphiphilic-modified polyethylene glycol.
2. The liposomal formulation as claimed in claim 1, wherein the cholesterol content is
between 35 and 45 mole-%.
3. The liposomal formulation as claimed in claim 1 or 2, wherein the content of nega
tive charge carriers is between 5 and 15 mole-%.
4. The liposomal formulation as claimed in claim 1, wherein amphoteric liposomes in
their membrane comprises neutral, cationic and anionic lipids, and the molar proportion of
anionic lipids is no higher than 40 mole-%, that of cationic lipids is no higher than 40 mole-
%, and that of neutral lipids is 30 to 80 mole-%.
5. The liposomal formulation as claimed in claim 1, wherein the liposome membrane
of said amphoteric liposomes contains neutral and amphoteric lipids and that the molar pro
portion of the amphoteric lipids is not higher than 40 mole-% and that of the neutral lipids 30
to 80 mole-%.
6. The liposomal formulation as claimed in claim 1, wherein the phospholipids are
selected from the group comprising dipalmitoylphosphatidyl choline, distearoylphosphatidyl
choline, dipalmitoyl phosphatidyl glycerol, distearoylphosphatidyl glycerol, dipalmitoyl
phosphatidyl serine, and distearoylphosphatidyl serine.

7. The liposomal formulation as claimed in claim any of claim 4 or 5,
wherein the neutral lipids are selected from the group comprising dimyristoylphosphatidyl choline , dipalmitoylphosphatidyl choline, palmitoyloleoylphosphatidyl choline ,distearoyl-phosphatidyl choline and/or cholesterol, or comprise purified choline fractions of natural origin such as soy phosphatidyl choline or egg phosphatidyl choline.
8. The liposomal formulation as claimed in claim 1,2 or 3, wherein the phospholipids
having negative charge are any of phosphatidyl glycerol and phosphatidyl serine, preferably
phosphatidyl glycerol or dipalmitoyl phosphatidyl glycerol.
9. The liposomal formulation as claimed in claim 1, wherein the water-soluble gluco-
corticoids are phosphate esters, glycosides or sulfate esters.
10. The liposomal formulation as claimed in claims 1 to 9,wherein the water-soluble
glucocorticoid is selected from the group comprising dexamethasone phosphate, dexa-
methasone dihydrogen phosphate disodium, triamcinolone acetonide phosphate, prednisolone
phosphate.
11. The liposomal formulation as claimed in claims 1 to 10 prepared as intramuscular
injection, subcutaneous injection, intravenous injection, nebulizer, suppositorie, suspension,
solution, gel, emulsion, brew-up formulation, drop, concentrate, syrup, bolus, aerosol, spray
and or inhalant.
12. The liposomal formulation as claimed in any of claims 1 to 11 is used for the treat
ment of inflammatory diseases, including rheumatoid arthritis.

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Patent Number

219583

Indian Patent Application Number

2412/DELNP/2005

PG Journal Number

26/2008

Publication Date

27-Jun-2008

Grant Date

08-May-2008

Date of Filing

06-Jun-2005

Name of Patentee

NOVOSOM AG

Applicant Address

Inventors:

#	Inventor's Name	Inventor's Address
1	PANZNER STEFFEN
2	BRAUER ROLF
3	RAUCHHAUS, UNA
4	KINNE RAIMUND W

PCT International Classification Number

A61K 9/00

PCT International Application Number

PCT/DE2003003893

PCT International Filing date

2003-11-24

PCT Conventions:

#	PCT Application Number	Date of Convention	Priority Country
1	102 55 106.5	2002-11-24	Germany